左旋多巴的生产

左旋多巴多巴的工业化生产研究

摘要：左旋多巴是生物体内一种重要的生物活性物质，是从L-酪氨酸到儿茶酚或黑色素的生化代谢途径过程中的重要中间产物，它是治疗帕金森病的有效药物。本文综述了左旋多巴的三种生产方式，即化学合成法、从植物中提取、微生物酶转化，以及左旋多巴的提取，其中利用微生物的酪氨酸分解酶以邻苯二酚、丙酮酸和氨为底物合成L-DOPA被证明是一种最经济且最有前途的方法。在左旋多巴的提取中，向其反应体系中加入晶种使多巴从反应体系中析出，除去菌体和杂质，再进行重结晶可得到纯度较高的多巴是一种很好的方法。

关键词：左旋多巴酪氨酸酚解酶微生物酶重结晶

1 前言

1.1 帕金森病简介

帕金森病（Parkinson's disease）又称"震颤麻痹"、巴金森氏症或柏金逊症，多在60岁以后发病。主要表现为患者动作缓慢，手脚或身体其它部分的震颤，身体失去柔软性，变得僵硬。震颤麻痹的病变原因是大脑和中脑的黑质纹状体变性，引起神经介质多巴胺减少而出现的一系列症状，据统计，普通人群帕金森病的发病率为0.1%，60岁以上老人的发病率为1%，80岁以上老人发病率为2%。而左旋多巴正是治疗帕金森病的常见有效药物。

1.2 左旋多巴的性质

L-DOPA:化学名L-3,4一二羟基丙氨酸，它是生物体内一种重要的生物活性物质，是从L-酪氨酸到儿茶酚或黑色素的生化代谢途径过程中的重要中间产物。其具有临二酚结构，性质不稳定，极易被空气中的氧气氧化变质。其水溶液久置后，可变黄、红、紫，直至黑色，高温、水、光、碱、重金属可加速其变化。对其鉴定的方法有两种，一种为将其溶于0.1mol/L盐酸溶液中，遇三氯化铁溶液显绿色，将该溶液分两份，一份加稀氨水显紫色，另一份加过量的氢氧化钠溶液显红色，另一种为将其水溶液加1%茚三酮溶液加热显红色。

1.3 左旋多巴的国内外研究进展

1911年人们首次利用3，4-碳酰二氧苯甲醛为原料化学合成L-DOPA，这些年来国内外尝试用化学合成法合成多巴的途径有很多，到70年代初，国外化学合成多巴的产量已达150吨。虽用化学法合成多巴的途径有许多，但遇到一个主要的困难是合成出来的产品是D-型和L-型的混合物，将二者分开较困难。1990 年, 西北工业大学的孙晓莉用可避免DL 拆旋操作的不对称合成法合成左旋多巴, 但工艺非常复杂。

1913年就有人从蚕豆籽苗种豆荚中提取天然L-DOPA，1949年从野生植物藜豆中提取出L-DOPA。国内于1972年从豆科植物藜豆种子中提取L-DOPA获得成功，1974年商品L-DOPA投放市场。从猫豆中提取L-DOPA的得率，从1.5%已提高到3.25%。但是从植物中提取L-DOPA由于受到原料来源的限制，产量小，远不能满足市场需求。

60年代末，国外一些学者开始致力于微生物酶法合成L-DOPA的研究。70年代初，日本学者Yamada等对微生物酶法合成L-DOPA进行了深入的研究，通过菌种选育及发酵条件的优化于1993年在味之素公司投入工业化生产。目前国外L-DOPA的产率超过100mg/mL.80年代后期，武汉大学的彭珍荣等在国内首先开展了微生物法合成L-DOPA的研究，但至今国内尚未有工业化的报道。虽然现在国内有多家制药厂生产L-DOPA及其药剂，但大都是从植物中提取的。

1.4 左旋多巴的应用前景

多巴的衍生物多巴胺是一种重要的神经递质，但多巴胺不能通过血脑屏障而进入脑组织，而L-DOPA可以通过血脑屏障，在脑组织中可脱羧形成多巴胺，可增加多巴胺含量而达到治疗帕金森氏病的功效。L-DOPA还有其他许多用途，可用来治疗腿多动综合症、肝昏迷、CO中毒、锰中毒和精神病、心力衰竭、溃疡病、脱毛症、调节人的性功能等。

帕金森病是一种因大脑内多巴胺匮乏引起的神经系统疾病, 其典型症状为震颤、肌强直、运动减少和姿式异常。60 年代以来, 多巴胺的前体—左旋多巴一直是治疗帕金森病的主要药物。随着我国人口老龄化速度的加快，对L-DOPA的需求将迅速增加,据1993年国家对消耗外汇的100种药物的统计，L-DOPA的进口总金额居第17位。而目前国内市场上的L-DOPA来源绝大部分依靠进口，如何能使微生物法合成L-DOPA在国内投入工业化生产是一个急待解决的问题。运用现代生物技术对菌种进行改造，期望获得高效表达酪氨酸酚解酶的菌株对于提高L-DOPA的产率是非常重要的。另外，固定化细胞法的进一步研究，可提高生产的连续性、稳定性、高效性。虽然L-DOPA的提取方法有多种多样，但L-DOPA易于氧化，这样给提取带来许多不便。又由于L-DOPA大都被用作药来治疗帕金森病，因而对此纯度要求很高，这样对下游提取技术提出更高的要求。L-DOPA作为药物被研究开发成为一个世界性的问题，亟待科研工作者的深入研究。

2 左旋多巴的生物转化途径

左旋多巴由芳香族氨基酸L一酪氨酸苯基的3 位上添加一个羟基而成, 可由一种或几种前体在单一酶催化下转化得到。因生产或研究中所用催化剂(酶或徽生物) 种类不同, 左旋多巴合成途径也不同, 一般有以下几种:

2.1 Tyrosinase转化法

Tyrosinase(E.C.1.14.18.1)即酪氨酸酶, 以铜离子为辅助因子, 兼具单酚醛化作用和二酚氧化还原作用, 在生物体内能催化黑色素的合成, 其中L一Tyrosine(L

一酪氨酸)—L一DoPa 是黑色素合成过程的中间反应。

1989年, 武汉大学的彭荣珍等用假单孢属细菌以酪氨酸为前体生产左旋多巴, 日本的Tanaka和武汉大学的王烨等还使用诱变育种的方法提高菌种产酶性

能以改善生产。以上研究结果普遍表现为左旋多巴的生产强度不高或酪氨酸的转化率较低, 可能与菌种产酶性能及前体酪氨酸在水相体系中的低溶解度有关。

2.2 Tyrosinase phenoL Lyase 转化法

Tyrosinase phenoL Lyase (E.c.4.1.99.2,又称β一Tyrosine) 即酪氨酸酚解酶, 该酶需以磷酸毗多醛(胺) 为辅酶, 以钾离子和氨离子为辅助因子, 能催化一系列β

一取代反应和可逆催化α，β一消除反应, 如:

邻笨二酚+ L (D )一丝氨酸— L一多巴+ 水

邻苯二酚+ 丙酮酸+ 氨一 L一多巴+ 水

当反应体系中氨离子浓度较高时, 有利于反应朝合成方向进行。

自然界中的许多细菌, 尤其是Escherichia（埃系氏菌属）、proteus变形菌属和Erwinia（欧文氏菌属）具有酪氨酸酚解酶的合成能力, 其中的Erwinia herbicoLa （草生欧文氏菌属）在研究中使用最多, 日本的Yana 等曾对Erwinia herbicoLa ATCC 21434 合成左旋多巴进行了广泛而深入的研究，并取得了很好的结果。另外,Symbiobacterium thermophiLum 等菌也有酪氨酸酚解酶的合成能力。

左旋多巴的前体在较高浓度时对酶活都有抑制作用, 其中邻苯二酚及丙酮酸除了有强抑制作用外, 还会导致酶的不可逆失活, 加人等摩尔硼酸根离子可减轻邻苯二酚对于酶的失活作用, 但邻苯二酚—硼酸复合物的存在会增强对酶的抑制作用。

由上述反应式可知, 以丝氨酸、邻苯二酚为前体(需氨存在)或以丙酮酸、邻苯二酚及氨为前体均可转化生成左旋多巴, 两者的差别在于丝氨酸与丙酮酸。以丙酮酸为前控制前体浓度和反应液pH 及温度可减少副产物的生成；以L(D)一丝氨酸为前体时, 对酶活影响较小,但反应时有部分转化为丙酮酸导致其转化率降低,另外, D一丝氨酸的转化率比L一丝氨酸低。

2.3 Transaminase 转化法

Transaminase (转氨酶)可将L一Asp或L 一GLu 上的氨基转移到3, 4 一二羟基苯丙酮酸(DoPP) 上生成L一Dopa。Nasasaki等在这方面做了较多的工作。

目前, 在研究中多采用1 法和2法, 途径3 少见报道。尚未有人对1、2 两种方法进行比较。从现有数据看, 采用Tyrosinase phenoL Lyase途径时产物浓度和前体利用率均较高,但由于前体具有毒性, 生产过程稍为复杂、操作要求较高; 如能获得高酶活菌株, 采用Tyrosinase 途径或许更有利于实际应用。