DNA印迹与杂交技术
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材料：尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜、二乙氨基乙基
纤维素滤膜（DEAE）
杂交模式图
－
DNA印迹转移
探针杂交
放射自显影
＋
A
B
C
M 琼脂糖凝胶电泳
bp
—1534
— 994 — 695
— 515
— 377 — 237
在 凝胶中DNA的变性为碱变性
凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断 裂为较短的单链 DNA，中性缓冲液中和 凝胶中的缓冲液。
Southern 凝 （b） 胶转移杂交
技术
基因组DNA
DNA限制片段
（c）
（d） 硝酸纤维素滤膜
（e）
同探针同源杂交的 基因DNA片段
X光底片
在大多数核酸杂交反应中，经过凝 胶电泳分离的DNA或RNA分子，都必 须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜 上，而且是按其在凝胶中的位置原封不 动地“吸印”上去的，因此，核酸杂交 也被称为“DNA印迹杂交”。
合成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA 中， 3H-尿苷可掺入到RNA中
体外标记法： 化学标记法：标记物分子上的活性基因与 探针分子上的某些基因反应， 标记物直接结合到探针分子上
三、Southern blotting
DNA印迹与杂交
1975年， 英国Edwen Southern 创建
定义：DNA杂交方法，即将DNA电泳 分离、转印到固相支持物上，用探针 进行检测的方法。
核酸分子杂交技术
DNA印迹与杂交技术 RNA印迹与杂交技术
组长：张伊佳 王东皞，方禹同，侯宇， 徐承硕
一、 分子杂交的基本方法
Southern 印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 Western 印迹法 液相杂交
核酸的分子杂交
将带有互补的特定核 苷酸序列的单链DNA或 RNA混合在一起，其相 应的同源区段就会退火形 成双链结构。如果退火的 核酸来自不同的生物有机 体，所形成的双链分子就 被称为杂种核酸分子。
（2）电转法
利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到 固相支持物上。
（3）真空转移法
此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜 在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上， 利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝 胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段 转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。
4.1 固相支持物的选择 （1）理想的固相支持物应具备的特性
①具有较强结合核酸分子的能力 ②不影响与探针的杂交反应 ③与核酸分子结合稳定牢固 ④具有良好的机械性能 非特异吸附少
4.2 常用的固相支持物 ①硝酸纤维素膜 ②尼龙膜 ③化学活化膜
4.3 Southern印迹的常用方法 （1）毛细管虹吸印迹法
Southern 印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 Western 印迹法 液相杂交
（一）Northern印迹杂交
1、 Northern blot印迹杂交是指待测RNA样品经 电泳分离后转移到固定支持物上，然后与标记的核 酸探针进行固-液相杂交。
2、基本原理和基本过程与Southern blot基本相同 3、鉴别RNA 4、探针可用DNA或RNA片段 5、待测样品为总RNA或mRNA
Southern杂交分为三步
1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点 预杂交液为不含DNA探针的杂交液
2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交 双链DNA探针需为单链，再杂交
3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的 DNA
最后为杂交结果的检测
化学显色或放射自显影
五、 其它分子杂交方法
利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的 DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是：容器 中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠， 上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤 纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动 凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA 片段移出凝胶而滞留在膜上。
酸分子链 间的氢键断裂。 （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使
双链核酸分子链间的氢键断裂。
（二） 复性
1、定义：变性的单链核酸分子在一定 条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸 的过程，称复性或杂交。
具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成 双链：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、 寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。
Southern bloting的主要步 骤
1.待测DNA样品的制备、酶切 2.待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电
泳
3.凝胶中DNA的变性：碱变性 4.Southern转膜(印迹)：
毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法
5.Southern杂交(预杂交、杂交、洗膜) 6.杂交结果的检测
（a）
Southern hybridization
补充知识：
（一）DNA变性与复性
DNA变性 1、定义：某些理化因素导致两条DNA链间的
氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性。
2、变性的方法： （1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸
分子链间的氢键完全断裂。 （2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核
标记物种类
• 核素标记物：32p、35s、3H • 非核素标记物
半抗原：生物素 配体：生物素是亲和素的配体 荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等 化学发光探针：标记物与某种底物反应发光，
如生物素酰化的碱性磷酸酶 可使发光底物发光
（三）标记方法
体内标记法：将核素标记的化合物作为合成 代谢的底物，在细胞合成代谢时使 核素掺入到新
探针
探针技能，它是指利用标记分子对其它分子的 识别性而实现对后者进行检测的一种技能，我们把 标记的分子叫探针（Probe）
从化学和生物学意义上理解，探针是一种分子， 它带有供反应后检测的合适标记物，并与特异靶分 子反应。如抗体--抗体、外源凝集素--碳水合合物、 亲合素--生物素、受体--配基（Ligand）以及互补 核酸间的杂交均属于探针--靶分子反应。
二、核酸分子杂交的基本原理
• 具有互补序列两条单链核酸分子在一定 条件下 按碱基互补配对原则退火形成双链 的过程。 • 杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列， 已知核酸序列称探针。
Hybridization of Nucleic Acids
DNA1 RNA
DNA2 DNA
探针
Northern hybridizatwk.baidu.comon
纤维素滤膜（DEAE）
杂交模式图
－
DNA印迹转移
探针杂交
放射自显影
＋
A
B
C
M 琼脂糖凝胶电泳
bp
—1534
— 994 — 695
— 515
— 377 — 237
在 凝胶中DNA的变性为碱变性
凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断 裂为较短的单链 DNA，中性缓冲液中和 凝胶中的缓冲液。
Southern 凝 （b） 胶转移杂交
技术
基因组DNA
DNA限制片段
（c）
（d） 硝酸纤维素滤膜
（e）
同探针同源杂交的 基因DNA片段
X光底片
在大多数核酸杂交反应中，经过凝 胶电泳分离的DNA或RNA分子，都必 须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜 上，而且是按其在凝胶中的位置原封不 动地“吸印”上去的，因此，核酸杂交 也被称为“DNA印迹杂交”。
合成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA 中， 3H-尿苷可掺入到RNA中
体外标记法： 化学标记法：标记物分子上的活性基因与 探针分子上的某些基因反应， 标记物直接结合到探针分子上
三、Southern blotting
DNA印迹与杂交
1975年， 英国Edwen Southern 创建
定义：DNA杂交方法，即将DNA电泳 分离、转印到固相支持物上，用探针 进行检测的方法。
核酸分子杂交技术
DNA印迹与杂交技术 RNA印迹与杂交技术
组长：张伊佳 王东皞，方禹同，侯宇， 徐承硕
一、 分子杂交的基本方法
Southern 印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 Western 印迹法 液相杂交
核酸的分子杂交
将带有互补的特定核 苷酸序列的单链DNA或 RNA混合在一起，其相 应的同源区段就会退火形 成双链结构。如果退火的 核酸来自不同的生物有机 体，所形成的双链分子就 被称为杂种核酸分子。
（2）电转法
利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到 固相支持物上。
（3）真空转移法
此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜 在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上， 利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝 胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段 转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。
4.1 固相支持物的选择 （1）理想的固相支持物应具备的特性
①具有较强结合核酸分子的能力 ②不影响与探针的杂交反应 ③与核酸分子结合稳定牢固 ④具有良好的机械性能 非特异吸附少
4.2 常用的固相支持物 ①硝酸纤维素膜 ②尼龙膜 ③化学活化膜
4.3 Southern印迹的常用方法 （1）毛细管虹吸印迹法
Southern 印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 Western 印迹法 液相杂交
（一）Northern印迹杂交
1、 Northern blot印迹杂交是指待测RNA样品经 电泳分离后转移到固定支持物上，然后与标记的核 酸探针进行固-液相杂交。
2、基本原理和基本过程与Southern blot基本相同 3、鉴别RNA 4、探针可用DNA或RNA片段 5、待测样品为总RNA或mRNA
Southern杂交分为三步
1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点 预杂交液为不含DNA探针的杂交液
2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交 双链DNA探针需为单链，再杂交
3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的 DNA
最后为杂交结果的检测
化学显色或放射自显影
五、 其它分子杂交方法
利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的 DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是：容器 中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠， 上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤 纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动 凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA 片段移出凝胶而滞留在膜上。
酸分子链 间的氢键断裂。 （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使
双链核酸分子链间的氢键断裂。
（二） 复性
1、定义：变性的单链核酸分子在一定 条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸 的过程，称复性或杂交。
具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成 双链：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、 寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。
Southern bloting的主要步 骤
1.待测DNA样品的制备、酶切 2.待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电
泳
3.凝胶中DNA的变性：碱变性 4.Southern转膜(印迹)：
毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法
5.Southern杂交(预杂交、杂交、洗膜) 6.杂交结果的检测
（a）
Southern hybridization
补充知识：
（一）DNA变性与复性
DNA变性 1、定义：某些理化因素导致两条DNA链间的
氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性。
2、变性的方法： （1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸
分子链间的氢键完全断裂。 （2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核
标记物种类
• 核素标记物：32p、35s、3H • 非核素标记物
半抗原：生物素 配体：生物素是亲和素的配体 荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等 化学发光探针：标记物与某种底物反应发光，
如生物素酰化的碱性磷酸酶 可使发光底物发光
（三）标记方法
体内标记法：将核素标记的化合物作为合成 代谢的底物，在细胞合成代谢时使 核素掺入到新
探针
探针技能，它是指利用标记分子对其它分子的 识别性而实现对后者进行检测的一种技能，我们把 标记的分子叫探针（Probe）
从化学和生物学意义上理解，探针是一种分子， 它带有供反应后检测的合适标记物，并与特异靶分 子反应。如抗体--抗体、外源凝集素--碳水合合物、 亲合素--生物素、受体--配基（Ligand）以及互补 核酸间的杂交均属于探针--靶分子反应。
二、核酸分子杂交的基本原理
• 具有互补序列两条单链核酸分子在一定 条件下 按碱基互补配对原则退火形成双链 的过程。 • 杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列， 已知核酸序列称探针。
Hybridization of Nucleic Acids
DNA1 RNA
DNA2 DNA
探针
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