原生质体培养与诱变解析
植物原生质体培养
第六章：植物原生质体培养请问同学们你知道哪些植物育种的方法？（杂交育种、诱变育种、多倍体育种、单倍体育种、基因工程育种、植物组织培养、植物体细胞杂交、动物细胞核移植等。
）自1999年11月20日中国的神舟飞船首飞获得成功后，2012年6月16日18时许中国的载人航天飞船“神舟九号”发射成功，6月29日10时许，神九载人飞船返回舱在内蒙古主着陆场安全着陆，这次发射验证了空间交会对接技术，首次实现地面向在轨飞行器进行人员和物资的往返运输与补给，我国的载人航天工程的“空间实验室”工程有望实现。
2002年12月30日凌晨“神舟”四号发射升天，一起带入太空的还有一批特殊的乘客——100粒牡丹花种子。
有着“牡丹城”之称的洛阳，将牡丹种子送上太空进行育种，是洛阳城“牡丹战略”的一个重要组成部分。
经过太空环境的各种重粒子、强辐射等作用，相当一部分种子的性状会发生较大的变异，也许牡丹花开的会更大更鲜艳。
“神舟四号”共搭载了几百种的植物种子、组织胚胎试管苗、生物菌种等。
此外，太空环境还是一个微重力环境。
中科院（上海生命科学研究院植物生理生态研究所和中科院上海生物化学细胞生物学研究所）的科研人员，分别将精心培育了10年的不同品系的烟草细胞，小白鼠淋巴细胞和骨髓瘤细胞也带入太空，进行了太空细胞电融合实验（由于重力沉降现象消失，不同的细胞更容易融合，提高融合率和细胞存活力），以期获得新品种。
这就是这则新闻提到的动植物细胞举行的“太空婚礼”。
自然条件下，植物间遗传物质的交换可以通过有性生殖来实现，保持物种稳定性的同时，也推动了物种的进化。
但物种间存在的生殖隔离，制约了物种间的遗传信息的交换和整合，也限制了通过杂交进行的作物遗传改良。
因此，人们就想方设法，从其它的途径寻找突破口。
细胞融合技术为克服这一障碍提供了一条新的途径。
而植物细胞是有细胞壁包裹的，实现细胞融合，首先要突破细胞壁的障碍。
6.1 原生质体的概念和研究进展6.1.1原生质体的概念原生质体(protoplast)：我们把除去细胞壁、裸露的、有生活力的原生质团或是说一个被质膜所包围的裸露细胞，称为原生质体。
麦考酚酸产生菌原生质体诱变育种的研究
ＡＢＳ ＴＲＡＣＴ
Ｔ ｅ ｅ ｔｈ ｇ ｃ ｐ ｅ ｏｉ ｃ ｄ ｐ ｏ ｕ ｉ ｇ ｍｕ ａ ｔ ｆ ｍ ｅ ｉｉ ｉ ｍ ｒｖｃ ｍ ａ ｔ ｍ， ｔ ｅ ｐ ｏ ｏ ｓ ｌｃ ｉｈ ｍｙ ｏ ｈ ｎ ｌ ａ ｉ ｒ ｄ ｃｎ ｔ ｎ ｓ ｒ ｃ ｏ Ｐ ｎ ｃｌ ｕ ｂ ｅ ｉｏ ｐ ｃ ｕ ｌ ｈ ｒ—
果 更好 。
原始菌株的麦考酚酸产量较低 ， 本文主要对麦考
酚酸产生菌的原生质体制备、 再生条件进行 了研究 ， 并 在 此基 础 上研 究 采用 紫 外 线 和亚 硝 酸 诱变 处 理 Ｐ ｎ－ ｅｉ ｃｌ ｍ ｂ ｖ ｏ ｐ ｃ ｍ原生质体 ， ｉｉ ｒ ｉ ｍ ａｔ ｌｕ ｅ ｃ ｕ 以期获得高产菌株 ， 并成功用于实际生产。
麦考酚酸酯（ ｙｏｈｎｌｅｍ ｆｉ Ｍ Ｆ 是麦考 ｍ ｃｐｅ ｏ ｔ ｏ ｔ， Ｍ ） ａ ｅｌ 酚 酸 （ ｙ ｏｈ ｎ ｌ ｃ ， Ａ） ２ 乙基 酯 衍生 物 ， ｍ ｃｐ ｅｏｉ ａｉ ＭＰ 的 ． ｃ ｄ 是
一
供 试 菌 株 短 密 青 霉 （ ｅｉｌｕ ｒｖｃ ｍ． Ｐ ｎｃｌ ｍ ｂ ｅ ｉｏ ｉｉ ｐ ｃ ｍ） ．， ａｔ Ａ ３ 由本 公 司提 供 。 ｕ
株生产能力提高 ２ ．％ ， ８ ２ 摇瓶和 ５ Ｌ 酵实验的效价均可达到 ６０ ｍ ／ ０ 发 ０ ０ ｇ Ｉ以上 。
ห้องสมุดไป่ตู้
关键词 ： 麦考酚酸 ； 原生质体 ； 诱变
中 图分 类 号 ：Ｒ ７ ． ９９５ 文 献 标 识 码 ：Ａ
Ｐｒ ｔ ｐ ａ ｔｍ ｕ ａ ｉ ｎ ｂ ｅ ｄ ｎ ｆｍｙ ｏ ｈ ｎ ！ ｃｄ ｐ ｏ ｕ ｉ ｇ ｓ ｒ ｉ ， ｏ ｏ ｌ ｓ ｔ ｔ ｒ ｅ ｉ ｇ ｏ ｃ ｐ ｅ ｏ ｉ ａ ｉ ｒ ｄ ｃｎ ｔ ａｎ ｏ ｃ Ｐｅ ｉｉ ｉ ｍ ｒ ｖｃ ｍｐ ｃ ｕ ｎ ｃｌ ｕ ｂ ｅ ｉ ・ ａ ｔ ｍ ｌ ｏ
专题16 植物细胞工程(解析版)
专题16 植物细胞工程专题分析➢题型解读本专题常结合动物细胞工程进行综合性考查，常出现在简答题中的某一问。
结合现代科学技术的实践应用进而培养学生的科学思维和社会责任感。
➢考向分析围绕细胞的全能性、植物组织培养、植物体细胞杂交技术进行考查，重点考查学生的实践应用能力。
➢答题技巧作答本专题时，需具备一定的理解能力，并牢记课本的重要知识点，通过一定的习题练习形成思维定势，从而迅速准确的作答。
对点训练一、单选题1．（2023·辽宁·模拟预测）马铃薯普通栽培种是同源四倍体，这使得马铃薯的杂交育种变得十分困难。
植物细胞工程技术为马铃薯育种提供了可行的育种方案。
下列有关植物细胞工程的说法，错误的是（）A．利用茎尖分生组织培养脱毒苗，使植株具备抗病毒的能力，产品质量得到提高B．利用普通马铃薯的花粉进行组织培养，可以获得含有2个染色体组的马铃薯C．利用原生质体融合实现体细胞杂交，可以克服远缘杂交不亲和的障碍，充分利用遗传资源D．利用培养的愈伤组织进行诱变育种，可以显著提高变异频率，获得有用的突变体【答案】A【详解】A、利用茎尖分生组织培养的是脱毒苗，但脱毒苗并不具有抗病毒的能力，A错误；B、由题可知，马铃薯是四倍体，其花粉含有2个染色体组，经过花药离体培养后的植株含有2个染色体组，B正确；C、不同生物之间存在生殖隔离，不能通过有性方式繁殖后代，通过植物体细胞杂交技术，可以实现不同生物之间的细胞融合，克服远缘杂交不亲和的障碍，充分利用遗传资源，C正确；D、愈伤组织细胞分裂比较旺盛，利用培养的愈伤组织进行诱变育种，可以显著提高变异频率，获得有用的突变体，D正确。
故选A。
2．某种植物组织培养的过程如下图所示，其中甲、乙、丙、丁代表4个不同培养阶段。
下列叙述正确的是（）A．上述过程属于体细胞胚发生途径，此过程涉及植物组织的脱分化和再分化B．甲阶段和乙阶段培养基中的营养成分不同，但生长调节剂种类和配比相同C．丙阶段，将丛状苗分株后移栽到只有生长素没有细胞分裂素的培养基上生根D．丁阶段，试管苗移栽前需在蛭石和珍珠岩等介质上锻炼，增强对低湿、弱光的适应能力【答案】C【详解】A、图示过程为器官发生途径，A错误；B、甲阶段和乙阶段培养基生长调节剂种类和配比不同，B错误；C、与发芽培养基相比，诱导根分化需要较低的细胞分裂素浓度，可以只有生长素没有细胞分裂素，C正确；D、试管苗移栽前需在蛭石和珍珠岩等介质上锻炼，增强对低湿、强光的适应能力，D错误。
EMS诱变步骤
EMS诱变步骤：
原生质体诱变时，buffer里要加15%的蔗糖、平板为R6；
孢子诱变时，需要在TSB预萌发
原生质体原液：109个/ml OK
稀释缓冲液：pH7.2 0.1M 磷酸缓冲液+15%蔗糖（过滤灭菌） OK
终止液:5%硫代硫酸钠+15%蔗糖溶液（过滤灭菌） OK
平板：R6 OK
消毒液：20%硫代硫酸钠溶液 OK
EMS 原液： OK
致死率：不同诱变条件下的致死率，从平板计数可直接得出
突变率：（1）表型多样性：再生后直接观察计数
（2）产量分布：需将各致死率下的克隆发酵，统计产量分布
甲基磺酸乙酯 Ethyl methylsulfonate
分子式: C3H8O3S; 分子量: 124.16, 沸点: 85-86℃
性质描述: 无色透明油状液体
相对密度1.1452 (10M/L)
溶于乙醚、乙醇、氯仿，微溶于水
终止液: 1M NaOH, 20% w/v Na2S2O3。
原生质体融合育种
（二）原生质体融合的影响因素 １、融合剂 电场融合的优点： 适于动植物、微生物细胞；融合频率高 可在显微镜下观察
（二）原生质体融合的影响因素
１、融合剂
２、温度 20~30℃
３、亲株的亲和力和原生质体的活性
４、无机离子
PEG介导融合 钙离子、镁离子
电场融合
糖或糖醇
四、融合体再生 复原： 再生培养基 细胞壁重建 形成菌落 P239 图9.8
第五节 酵母菌原生质体融合育种 一、酵母细胞壁结构和遗传标记 菌龄对原生质体形成影响大 亲本灭火的方法：紫外线
热 药物
第五节 酵母菌原生质体融合育种 一、酵母原生质体制备 p259 预处理：EDTA；巯基乙醇
蜗牛酶
第六节 霉菌原生质体融合育种 二、培养基及相关溶液 p262 （1）查氏培养基的作用：菌丝生长 （3）酶液的制备：
（2）菌体培养方式：
1.平板玻璃纸法：
丝状菌
2.振荡沉没培养法
细菌和酵母菌
酶法分离原生质体的影响因素？
（3）菌体年龄
丝状真菌
菌丝体尖端细胞
放线菌
对数期到静止期
细菌
对数期
酵母菌
菌体同步化
酶法分离原生质体的影响因素？
（4）稳定剂
高渗溶液
无机盐：NaCl、KCl、MgSO4、CaCl 微生物原生质体育种 三、原生质体转化育种 何种形式DNA转化率高？ 质粒
第一节 微生物原生质体育种
五、其他微生物原生质体育种 脂质体转移 原生质体转染等
第二节 微生物原生质体融合育种
微生物原生质体融合育种：
通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原 生质体发生融合，并产生重组子的过程。
微生物遗传育种名词解释（二）
微⽣物遗传育种名词解释（⼆）1、⾃然选育：从⾃然界直接分离和筛选菌种或在⽣产中利⽤⾃发突变选育优良菌株。
2、诱变育种：对出发菌株进⾏诱变，然后运⽤合理的程序与⽅法筛选符合要求的优良菌株。
3、代谢调控育种：利⽤现有的代谢调控知识，筛选特定突变型，改变代谢流量或流向，从⽽提⾼⽬的产物产量的⼀种育种技术。
4、重组育种；利⽤微⽣物间的遗传重组来改变其遗传物质组成及结构的⼯业微⽣物育种技术。
5、原⽣质体融合育种；通过⼈为⽅法，使遗传性状不同的两细胞的原⽣质体发⽣融合，从⽽实现遗传重组的⼯业微⽣物育种技术。
6、基因⼯程育种技术：在体外构建重组DNA分⼦并导⼊宿主内⾼效表达，从⽽获得重组微⽣物的育种技术。
7、突变：遗传物质核酸中的核苷酸序列发⽣了稳定的可遗传的变化。
8、突变体：带有突变基因的细胞或个体9、突变型：突变体的基因型或表型称为突变型，和其相对的原存在状态称为野⽣型。
10、⾃发突变（spontaneous mutagenesis）：未经任何⼈为处理⽽⾃然发⽣的突变；11、诱发突变（induced mutagenesis）：由⼈们有意识地利⽤物理或化学⼿段对⽣物体进⾏处理⽽引起的突变。
12、整倍体：含有完整的染⾊体组。
13、⾮整倍体：含有不完整状态的染⾊体组，⼀般是指⼆倍体中成对染⾊体成员的增加或减少。
14、部分⼆倍体：原核⽣物中由⼀整条染⾊体和外来染⾊体⽚段所构成的不完整⼆倍体。
增变基因（mutator gene）：其基因突变会导致整个基因组的突变频率明显上升的⼀些基因。
15、前突变：诱变剂所造成的DNA分⼦某⼀位置的损伤16、光复活：指细菌在紫外线照射后⽴即⽤可见光照射，可以显著地增加细菌的存活率，降低突变率。
17、表型延迟phenotype lag：突变体表型改变落后于其基因型改变的现象。
18、分离性延迟segregational lag ：突变基因由杂合状态到纯合状态所造成的表型迟延19、⽣理性延迟physiological lag ：由于基因产物的“稀释”过程所造成的表型迟延野⽣型（wild type）：从⾃然界分离到的任何微⽣物在其发⽣营养缺陷突变前的原始菌株；基因重组：由于不同DNA链的断裂和连接⽽产⽣DNA⽚段的交换和重新组合，形成新的DNA分⼦，进⽽形成新遗传个体的⽅式称为基因重组。
2025届高中生物学一轮复习检测案40 植物细胞工程(含解析)
检测案40植物细胞工程[基础巩固练]考点一植物组织培养1．利用植物组织培养技术不仅能保持母本优良的遗传性状，实现苗木的快速繁殖，还可以进行品种改良。
如图表示利用棉花叶肉细胞，进行诱变育种的过程，据图分析错误的是（）A．③过程需要一定的光照B．①过程需在浓度略大的环境中进行C．④过程需定期观察和记录愈伤组织的生长情况D．②过程能使原生质体发生基因突变和染色体变异2．下列关于菊花组织培养的叙述，正确的是（）A．用自然生长的茎段进行组培须用适宜浓度的乙醇和次氯酸钠的混合液消毒B．可取菊花芽尖进行培养获得不带病毒的抗病毒苗C．组培苗锻炼时采用蛭石作为栽培基质的原因是蛭石带菌量低且营养丰富D．不带叶片的菊花幼茎切段可通过器官发生途径形成完整的菊花植株考点二植物体细胞杂交3．下列有关植物细胞工程的叙述，正确的是（）A．脱分化的实质是通过基因的选择性表达改变细胞的结构和功能B．植物体细胞杂交培育出的新品种植株有可能是单倍体C．菊花组织培养选择外植体，通常选用分裂能力强的新生细胞D．植物细胞培养中获得了许多细胞代谢产物体现了细胞全能性4．科研人员利用植物体细胞杂交技术培育矮牵牛新品种，技术流程示意图如下。
下列叙述正确的是（）A．愈伤组织是幼嫩叶片通过细胞分化形成的B．获得的杂种植株都能表现双亲的优良性状C．可用聚乙二醇诱导原生质体甲和乙的融合和细胞壁再生D．用纤维素酶和果胶酶处理愈伤组织以获得原生质体5．如图列举了几种植物的育种方式，下列相关叙述正确的是（）A．甲过程形成的细胞c内的染色体数一定是a细胞内染色体数的两倍B．乙方式射线处理后可以获得大量的具有有利性状的材料C．通过丁方式，细胞c发育成新植株涉及同源染色体的联会与分离D．与杂交育种相比，丙方式能克服远缘杂交不亲和的障碍考点三植物细胞工程的应用6．如图表示利用棉花叶肉细胞原生质体培养进行遗传改良的过程，据图分析错误的是（）A．①过程需用酶解法去除细胞壁B．②过程能定向诱导原生质体产生优良性状的突变C．③过程中叶肉细胞失去了其特有的结构和功能D．④过程是再分化过程，涉及细胞的分裂和分化[提能强化练]7．（不定项）花粉植株是体细胞遗传研究和突变育种的理想材料。
原生质体诱变方法
2.4 试验方法2.4.1 酶液配制称取适量固体酶（w/v)，溶于0.6mol/L渗透压稳定剂中，0.22μm微孔过滤膜过滤除菌后备用。
2.4.2菌丝培养取直径1cm的菌丝块接种于盛有100mL液体培养基的250mL三角瓶中，每瓶接种一块，25℃静置培养3-7d。
2.4.3原生质体制备与计数将培养好的菌丝置于离心管中，10000r/min离心15min，弃去上清液，用相应稳渗剂洗涤3次，无菌滤纸吸去多余水分。
每250mg湿菌丝加1mL酶液，在适当温度水浴中酶解一段时间，酶解过程中每隔一段时间震荡混匀一次，吸取少许酶解液，血球计数板计数。
原生质体制备是菌种选育及其遗传研究的一个重要组成部分，确定了滑菇原生质体形成的最适条件：以0.6mol/L的MgSO4为稳渗剂，在2%的蜗牛酶和纤维素酶的混合酶、pH6.5、酶解温度30℃的条件下对培养7d的菌丝进行酶解，在此条件下所得原生质体的产量为3.92×106个/mL。
1.5.3 原生质体再生1.5.3.1 原生质体纯化（崔宗强，2003）酶解后的原生质体悬浮液经脱脂棉柱（5mL 注射器中塞入0.5-1.0cm 高的脱脂棉，稍压实）过滤除去残余菌丝，滤液4200r/min 离心10min，去上清液，用渗透压稳定剂洗2 次，得到纯化原生质体。
吸取少许悬液，血球计数板计数。
1.5.3.2 原生质体再生将适量原生质体悬液稀释到一定浓度后，吸取0.1mL 涂布再生固体平板。
同时用无菌水涨破原生质体后，以同样方法涂布再生固体平板，以消除非原生质体所形成的菌落带来的误差。
原生质体再生率的计算：再生率（％）＝（原生质体再生菌落数－对照组再生菌落）/原生质体总数×100％。
1.5.3.3 再生培养基的选择在30℃、pH6.0、1.5%酶液条件下，以0.6mol/L KCl 作为稳渗剂，酶解3h 得到冬虫夏草原生质体。
将所得原生质体过滤、纯化后吸取0.1mL 分别涂布 5 种不同再生培养基，25℃培养5d。
原生质体制备和再生的影响因素
原生质体制备和再生的影响因素【摘要】以酿酒酵母YS5为出发菌株，经蜗牛酶酶解获得原生质体后，用紫外线进行诱变处理，通过一级筛选得到了61株诱变菌株，将这些诱变株直接进行发酵，利用气相色谱对发酵液酒精产量进行分析。
结果表明，经过紫外线照射30s后，通过筛选获得了一株酒精发酵较高产菌株，酒精产率达到了10.36%（v/v），比出发菌株提高了3.6%。
【关键词】酿酒酵母；原生质体；紫外诱变；甘蔗汁发酵酵母细胞的融合及酵母原生质体的诱变的一个重要前提就是如何制备大量的原生质体，原生质体制备率受到各种条件的影响，如菌龄、酶浓度、温度、预处理等的影响，因此确定不同因素对酵母原生质体的影响及优化不同因素，可以大大提高产率。
1.菌体菌龄对原生质体制备的影响微生物的生理状态是决定原生质体产量的主要因素之一，特别是菌龄，明显影响原生质体释放的频率。
不同时期的菌体，对各种溶壁酶的敏感性不同，原生质体的形成率与再生率也有很大差异。
较年轻的菌体细胞制备原生质体较为容易，而且此阶段的原生质体再生率也较高。
处于对数生长期的菌体代谢活性高而稳定、细胞壁对酶的作用较为敏感，且大小比较一致，生长适应能力强，故通常取处于对数生长期的菌体制备原生质体。
有研究表明对数生长早期形成率最高，对数生长中期时再生率最高，对数生长晚期的再生率也比对数生长中期的低。
这是由于细胞壁越稚嫩，越易被酶破坏，对数生长早期菌体幼小，代谢活性高而稳定、细胞壁对酶的作用较为敏感，且大小比较一致，故生活适应能力强；对数生长中期幼小菌体对不利因素抵抗能力差，一旦失去细胞壁，较难恢复；对数生长晚期的原生质体存在着很大比例的非活性个体。
菌体如果进入稳定期，细胞壁结构趋于稳定和老化，不易去壁形成原生质体，原生质体形成率显著降低，而且再生率也有所下降。
微生物的菌龄是随着菌种和培养条件而异，酵母菌菌液中加入β-巯基乙醇可以破坏细胞壁组分中的二巯基，处于对数生长期的酵母菌菌体代谢极为旺盛，细胞壁易被瓦解，其细胞壁对蜗牛酶较为敏感，易于酶解脱壁，且酵母菌制备原生质体时，要使菌体同步化才能大幅度的提高制备率。
原生质体
原生质体融合的优越性
原生质体制备 原生质体融合和再生 融合子的检出 用于选育高产优质菌株 产生新的产物
融合方法
在育种中的应用
原生质体融合的优越性
受接合型或致育型的限制小，两亲株没有供体和受体之分 有利于不同种属微生物的杂交充分,完善。
可采用温度，药物，紫外线等处理纯化亲株的一方或双 方然后使其融合，筛选再生重组子菌落，提高筛选效率。 用微生物的原生质体进行诱变，可明显提高诱变频率。
融合子的检出
融合子是在选择性培养基上检出的，即通过两个 遗传标记互补确定的。此外可以利用荧光染色， 将两个亲株用不同的荧光色素染色并融合后，在 落射荧光装置的立体显微镜下观察融合子；如在 一个个体上观察到双亲的两种荧光色素，即为融 合子。
工业微生物育种复习题解析
工业微生物育种复习题解析第一章绪论1.什么是工业微生物？作为工业微生物应具备哪些特征？答：工业微生物：对自然环境中的微生物经过改造，用于发酵工业生产的微生物。
具备特征：(1)菌种要纯(2)遗传稳定且对诱变剂敏感(3)成长快，易繁殖(4)抗杂菌和噬菌体的能力强(5)生产目的产物的时间短且产量高(6)目的产物易分离提纯2.工业微生物育种的基础是什么？答：工业微生物育种的基础是遗传和变异。
3.常用的工业微生物育种技术有哪些？答：常用技术：(1)自然选育【选择育种】(2)诱变育种(3)代谢控制育种(4)杂交育种(5)基因工程育种第二章微生物育种的遗传基础1.基因突变的类型有哪些？答：有碱基突变，染色体畸变2.叙述紫外线诱变的原理？答：原理：紫外线对微生物诱变作用，主要引起DNA的分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。
3.基因修复的种类有哪些？答：种类：(1)光复活修复(2)切除修复(3)重组修复(4)SOS修复4.真核微生物基因重组的方式有哪些？答：方式：(1)有性杂交(2)准性生殖(3)原生质体融合第三章出发菌株的分离与筛选1.什么是富集培养？答：富集培养：指在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境中的优势种，以利于分离到所需要的菌株。
2.哪些分离方法能达到“菌落纯”？哪些分离方法能达到“细胞纯（菌株纯）”？答：菌落纯：稀释分离法、划线法、组织法细胞纯：单细胞或单孢子的分离法3.分离好氧微生物常用的方法有哪些？答：(1)稀释涂布法(2)划线分离法(3)平皿生化反应分离法4.平皿生化反应分离法有哪些？分别用来筛选哪些菌？各自原理如何？答：(1)透明圈法原理：在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊，能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小可以放映该菌株利用底物的能力。
第6章原生质体培养与诱变
5、原生质体活力测定
(四)氧电极法
有活力的原生质体在光照下会进行光合作用 而放出氧气，在没有光照的条件下进行呼吸 而耗氧。 因此，可以采用氧电极来测定氧的变化来判 定原生质体是否具有活力。
5、原生质体活力测定
影响原生质体数量和活力的因素
供试材料及预处理方法
酶解条件
酶质量、组合、浓度、pH、光照和温度
体分离速度快，但细胞活力差，被破 坏的细胞较多; pH值偏高（7.0） ，酶活力差，原生 质体分离速度慢，完整的原生质体数 目较多。
5、原生质体活力测定
光照
制备原生质体时，在细胞中加入酶液、渗透
压稳定剂、质膜稳定剂后，还需在一定时间 内保持一定的温度，原生质体方能释放。
脱壁的原生质体对光非常敏感，分离原生质
原生质体培养与诱变
主要内容
原生质体的培养
原生质体分离纯化 原生质体鉴定与活力测定 原生质体培养与植株再生 原生质体变异 自发突变 原生质体诱变
原生质体(PROTOPLAST)：
指除去细胞壁裸露的球形细胞，又称 原生质球 。
一、植物原生质体的特点
1、无细胞壁障碍：原生质体能摄取DNA，质粒、 病毒、细菌、细胞器等外源物质，是植物细 胞工程进行遗传操作、基因转移的良好材料； 2、具有全能性：具有全套的遗传物质，具有
从而促进了原生质体的分裂和细胞团的形成。
7、原生质体培养--植株再生
原生质体培养的植株再生一般经过细胞壁 再生、细胞分裂成细胞团、愈伤经原生质 体培养的植物再生一般经过细胞壁再生、 细胞分裂成细胞团、愈伤组织(或胚状体)、 分化成芽和根、完整植株这几个过程。
常用酶包括:琼脂酶、果胶酶、纤维素酶等，
微生物育种资料名词解释富集培养目的微生物含量较少时根据
微生物育种资料名词解释1．富集培养：目的微生物含量较少时，根据微生物生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利生长条件，是目的微生物在最适环境下迅速生长繁殖，数量增加，由劣种变为优势种，以利用分离所需要的菌种。
2．营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养（氨基酸、维生素、核酸等）的能力，只有在基本培养基中补充所缺失的营养因子才能生长。
3．常规杂交育种：通过接合、转化、转导、溶源转化和转染等方式来获得重组体的杂交育种方法。
4．原生质体融合育种：通过酶解破除细胞壁后，制备微生物原生质体，然后诱导原生质体融合杂交，双亲本不受亲和力限制，甚至可以打破种属间遗传障碍。
获得远缘杂交重组体的特殊方式。
5．原生质体再生育种：微生物制备原生质体后直接再生，从再生菌落中分离筛选变异菌株，最终得到优良性状提高的正变菌株。
6．原生质体诱变育种：以微生物原生质体为育种材料，采用物理或化学诱变剂处理，然后分离到再生培养基中再生，并从再生菌落中筛选高产突变菌株。
解答1．工业生产的微生物菌种的特性①在遗传上必须是稳定的②易于产生许多营养细胞、包子或其他繁殖体②必须是纯种，不应带有其他杂菌及噬菌体④种子的生长必须旺盛、迅速⑤产生所需要的产物时间短⑥比较容易分离提纯⑦有自身保护机制，抵抗杂菌污染能力强⑧能保持较长的良好经济性能⑨菌株诱变处理较敏感，从而可以选育出高产菌株⑩在规定时间内，菌株必须产生与其数量的目的产物，并保持相对地稳定2．工业微生物的发展史（1）诱变育种。
以人工诱变手段诱发微生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选，从多种多样的变异体中筛选出产量高、性状优良的变异株，并找出发挥这个变株最佳培养基和培养条件，使其在最是环境条件下合成有效产物。
（2）杂交育种。
使双亲或多亲的遗传物质重新组合，以获得综合双亲优良性状的新品种的育种方法。
（3）代谢控制育种。
进行内因改变，通过定向选育某种特定的突变型，以达到大量积累由于产物的目的，定向选育包括改变代谢代谢通路；降低支路代谢终产物产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜通透性。
原生质体制备和再生的影响因素
原生质体制备和再生的影响因素【摘要】以酿酒酵母YS5为出发菌株，经蜗牛酶酶解获得原生质体后，用紫外线进行诱变处理，通过一级筛选得到了61株诱变菌株，将这些诱变株直接进行发酵，利用气相色谱对发酵液酒精产量进行分析。
结果表明，经过紫外线照射30s后，通过筛选获得了一株酒精发酵较高产菌株，酒精产率达到了10.36%（v/v），比出发菌株提高了3.6%。
【关键词】酿酒酵母；原生质体；紫外诱变；甘蔗汁发酵酵母细胞的融合及酵母原生质体的诱变的一个重要前提就是如何制备大量的原生质体，原生质体制备率受到各种条件的影响，如菌龄、酶浓度、温度、预处理等的影响，因此确定不同因素对酵母原生质体的影响及优化不同因素，可以大大提高产率。
1.菌体菌龄对原生质体制备的影响微生物的生理状态是决定原生质体产量的主要因素之一，特别是菌龄，明显影响原生质体释放的频率。
不同时期的菌体，对各种溶壁酶的敏感性不同，原生质体的形成率与再生率也有很大差异。
较年轻的菌体细胞制备原生质体较为容易，而且此阶段的原生质体再生率也较高。
处于对数生长期的菌体代谢活性高而稳定、细胞壁对酶的作用较为敏感，且大小比较一致，生长适应能力强，故通常取处于对数生长期的菌体制备原生质体。
有研究表明对数生长早期形成率最高，对数生长中期时再生率最高，对数生长晚期的再生率也比对数生长中期的低。
这是由于细胞壁越稚嫩，越易被酶破坏，对数生长早期菌体幼小，代谢活性高而稳定、细胞壁对酶的作用较为敏感，且大小比较一致，故生活适应能力强；对数生长中期幼小菌体对不利因素抵抗能力差，一旦失去细胞壁，较难恢复；对数生长晚期的原生质体存在着很大比例的非活性个体。
菌体如果进入稳定期，细胞壁结构趋于稳定和老化，不易去壁形成原生质体，原生质体形成率显著降低，而且再生率也有所下降。
微生物的菌龄是随着菌种和培养条件而异，酵母菌菌液中加入β-巯基乙醇可以破坏细胞壁组分中的二巯基，处于对数生长期的酵母菌菌体代谢极为旺盛，细胞壁易被瓦解，其细胞壁对蜗牛酶较为敏感，易于酶解脱壁，且酵母菌制备原生质体时，要使菌体同步化才能大幅度的提高制备率。
第40讲 植物细胞工程(练习)(解析版)
第40讲植物细胞工程1．（2023秋·云南·高二校联考阶段练习）下列关于生物变异与育种的叙述，错误的是（）A．基因重组可能产生新的基因组合B．单个等位基因突变可通过显微镜观察确认C．培育多倍体植株的过程中，染色体组数目增加D．单倍体的染色体数目与本物种配子的相同【答案】B【分析】杂交育种：杂交→自交→选优；诱变育种：物理或化学方法处理生物，诱导突变；单倍体育种：花药离体培养、秋水仙素加倍；多倍体育种：用秋水仙素处理萌发的种子或幼苗；基因工程育种：将一种生物的基因转移到另一种生物体内。
单倍体育种：采用花药离体培养的方法获得单倍体植株，然后经过人工诱导使染色体数目加倍，重新恢复到正常植株的染色体数目。
【详解】A、基因重组可能产生新的基因组合，但不能产生新基因，A正确；B、单个等位基因突变属于分子水平的变化，不能通过显微镜观察确认，B错误；C、培育多倍体植株的过程中，可通过低温诱导或秋水仙素处理使染色体组数目增加，C正确；D、单倍体发育起点为配子，因此单倍体的染色体数目与本物种配子的相同，D正确。
故选B。
2．（2023秋·高三课时练习）青霉素能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用，早期科学家只能从青霉菌中提取少量青霉素，随着高产菌种的选育、发酵技术的发展等，青霉素步人产业化生产的道路。
下列叙述正确的是（）A．可通过诱变育种的方法，选育出高产青霉素的菌株B．青霉素生产和泡菜的制作都需要隔绝氧气来发酵生产细胞的代谢产物C．因青霉素具有杀菌作用，青霉素的生产中使用的培养基和发酵设备不需严格灭菌D．青霉素破坏细菌的细胞壁，导致细菌细胞不能发生渗透作用吸水而死亡【答案】A【分析】微生物实验室培养的关键在于防止杂菌污染，因此在培养过程中必须严格无菌操作，配置好的培养基需用高压蒸汽灭菌。
【详解】A、因为青霉菌本身产生少量青霉素，所以可以通过诱变育种的方法，选育出高产青霉素的菌株，A正确；B、青霉菌属于需氧菌，青霉素生产中需要通气来发酵生产细胞的代谢产物，B错误；C、青霉素能干扰细菌细胞壁的合成，所以发酵过程中不会有细菌污染，但其他的杂菌依然可能滋生，因此青霉素的生产中使用的培养基和发酵设备需要严格灭菌，C错误；D、青霉素破坏细菌的细胞壁，导致细菌细胞能发生渗透作用吸水涨破而死亡，D错误。
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先低速离心，将原生质体悬浮于21%蔗糖溶液中，离 心，吸取表层原生质体（漂浮法）。再重新悬浮、离心， 收集底部沉淀即为高纯原生质体。重复2-3次。
烟草叶肉细胞原生质体离心漂浮法分离纯化流程
▲ 烟草悬浮细胞： 2% Driselase纤维素酶+2% Cellusase纤维素酶+ 0.5% Macerozyme果胶酶；海水。
▲ 胡萝卜悬浮培养的细胞： 2% Onozuka纤维素酶+0.5% Driselase纤维 素酶+0.5% Rhoxyme半纤维素酶1% Pectinase果胶酶；0.35M甘露醇 + 0.35M 山梨醇
– 优点： 条件温和，原生质体完整性好，活力高，得率高。 几乎所有植物器官组织或细胞均可用酶解法获得原生质体。
– 缺点：酶制剂中均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及 酚类物质，影响所获原生质体的活力。
举例:不同植物原生质体分离所用的酶液和质膜稳定剂
▲ 烟草叶肉细胞：0.5% Macerozyme R-10果胶酶+2% Onozuka R-10纤 维素酶，0.7M 甘露醇。
▲ 甘蓝等的根细胞：4% Maicelase纤维素酶+2% Rhozyme半纤维素酶 +0.3% Macerozyme果胶酶； 0.7M 甘露醇。
▲ 番茄无菌苗的子叶和叶肉细胞：1.5% Cellulysin 纤维素酶+0.3% Macerozyme果胶酶；102.6g/L 蔗糖。
▲ 水稻种子的愈伤组织的悬浮培养细胞：2% Onozuka Rs 纤维素酶+1% Driselase 纤维素酶+2% Macerozyme R-10果胶酶+1% Pectolyase果 胶酶 ；0.3M 葡萄糖
2 原生质体活力(性)测定
2.1 染色法
（1）荧光素双醋酸盐（FDA）染色法 在活细胞中，FDA被酯酶裂解，释放出有Байду номын сангаас性的荧光
素。荧光素不能穿越质膜，在活细胞中积累，在UV照 射下发出绿色荧光。
（2）酚藏花红染色法 在载玻片上各加1滴原生质体悬浮液和0.1%酚藏花红溶 液，不着色则具有活性，着红色的为死亡原生质体。
第6章 原生质体培养与诱变
§6.1 原生质体培养
• 原生质体概念与特征 • 原生质体分离纯化 • 原生质体鉴定与活力测定 • 原生质体培养与植物再生
原生质体的概念、特征及意义
• 概念： – 除去植物细胞壁的裸露细胞，称为原生质体
• 特征：
（1）除去细胞壁的原生质体，便于摄取外源DNA、细菌等物 质，为基因转移和细胞工程遗传操作提供了良好材料；
（3）伊文斯兰染色法 用0.25% Evans blue对纯化后的原生质体染色：显示 无色则表示有活力，显示蓝色则反映是死原生质体。
2 原生质体活力(性)测定
2.2 胞质环流法
在显微镜下观察原生质体，有胞质环流者为活细胞。
2.3 渗透压变化形态观察法
将原生质体放入低渗液中，显微观察细胞体积会膨胀变 大甚至胀破无形；放入高渗液中则体积缩小，发生这样 形态变化者为活力原生质体，体积不变为死亡原生质体。
2.4 氧电极法
而化有无即活可光力确时的定则原原因生生呼质质吸体体消在是耗光否O照2有，下活用会力氧进。电行极光来合测作定用O释2体放积O变2，
6.1.3 原生质体培养与植株再生
注意要点：
– 培养起始密度调 节为104 -106 个 /mL
– 酶解脱壁后，先 用高渗培养液预处理， 再逐渐降至正常渗透 压培养。
3、原生质体的纯化
• 指去除破碎的原生质体、未去壁的细胞、细 胞器及其他碎片等杂质，并与酶液分离。
(1) 过滤离心法 (2) 漂 浮 法 (3) 沉降法和漂浮法
3、原生质体纯化方法
(1)过滤-离心法
用40~100µm网筛过滤除去细胞团、未去壁细胞及碎 片，再在适当介质下离心3-4次，收集得到的原生质体。 (2) 漂浮法
6.1.2 原生质体鉴定与活力测定
1、原生质体鉴定
目的是检验原生质体去壁后的纯度。 （1）低渗爆破法
把纯化后原生质体放到低渗透压洗涤液中，显微观察原 生质体是否会吸水胀破：原生质体胀破后是不留残迹的， 而含有细胞壁的细胞残迹保持半圆形壁。
（2）荧光染色法 用0.01%荧光增白剂如FDA对纯化后的 原生质体染色5-10min，离心除去多余 染料，用荧光显微镜在366nm紫外光下 观察有无荧光：发出黄绿色荧光的表示 细胞壁没去除。
由细胞团进一步形成愈伤组织或胚状体。
原生质体的培养过程
1、细胞壁再生：
首先体积膨大，叶绿体重新排列，新的细胞壁开始合成，细胞由 球形变成椭圆形。
2、细胞分裂形成细胞团：
一般在培养2-3天后细胞质增加，细胞器增殖，RNA、蛋白质等 合成增加，细胞分裂，形成小的细胞团，应不断更换培养液。发育 成愈伤组织或胚状体。
3、愈伤组织或胚状体的形成：
（2）具有全能性，可再生成完整植株； （3）利于通过细胞融合形成杂种植株，培育新品种，特别是 克服种间不亲和障碍。
植物原生质体
蔡司confocal镜下拟南芥原生质体中叶绿体 内膜（红光）、叶绿体蛋白-GFP（绿光）
纯化后的叶肉原生质体
植物原生质体培养意义
信息传递、能量转换 细胞壁合成机理 膜的结构与功能 核质关系 杂交或自交不亲和的机理 细胞间的相互作用 植物激素的作用机理
融合产生体细胞杂种 分离各种细胞器 引入各种细胞器 导入外源基因 诱发突变体
1.1 原生质体分离纯化
1、原生质体材料来源
★ 植物叶片
－取材容易 －比较容易用酶解法分离
★ 植物根尖组织
－可由各种植物的种子萌发后取得
★ 植物花粉
－产生单倍体原生质体
★ 愈伤组织、悬浮培养的细胞
－细胞壁容易解离
2、原生质体的分离方法
★ 机械分离法
－先将细胞放在高渗溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分 离，原体质体收缩成球形式，再用机械法磨碎细胞，从伤 口处可以释放出完整的原生质体。
－优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。 －缺点：获得完整的原生质体的数量比较少。
★ 酶解分离法
– 常用的细胞壁降解酶种类：纤维素酶、半纤维素酶、果胶 酶、琼脂酶、果酸酶等