流式细胞仪结果分析ppt课件

垂直相交 激发发光
荧光检测系统和
收集光信号 光电倍增管
放大 脉冲信号
散射光感受系统
计算机系统 分析结果
流式细胞仪与显微镜的区别
区别 光源 对象 承载工具 检测信号 放大方式 统计 结果
流式细胞仪 激光
细胞、生物粒子 鞘液及流动室 光学信号 PMT、放大电路 计算机，>5000
多参数，综合分析
显微镜 自然光、灯光 细胞、组织等
液流系统示意图
鞘液
喷嘴
Fluorescence signals
Focused laser beam
FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
（2）光学系统
• 激光光源：气冷式氩离子激光器 • 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长
波长 • 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 • 透镜组：形成平行光，除去室内光 • 滤片：长通、短通、带通 • 光电倍增管：FS, SS（散射光），
• 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的 多个不同特征。
• 线性放大器和对数放大器
荧光染料的特性
•激发波长(EXCITING) •发射波长(EMISSION)
荧光补偿
四、细胞分选原理
通过流式细胞仪进行细胞分选 主要是在对具有某种特征的细胞需 进一步培养和研究时进行的。
（一）分选基本原理
载玻片 形态及染色 目镜×物镜、光学放大 人工，200 简单，单参数
二、散射光的测定
细胞在液柱中与激光束相交时 向周围360°立体角方向散射的光线 信号，它的强弱与细胞的大小、形 状、胞内颗粒折射等有关，主要分
为前向散射光和侧向散射光。
前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光 以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞 等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。
流式细胞仪常检测的细胞特性
细胞组成
细胞功能
大小 粒度 DNA, RNA含量 蛋白质含量 钙离子, PH值, 膜电位
细胞表面/胞浆/核--特异性抗原 细胞活性 胞内细胞因子 激素结合位点 酶活性
一、工作原理
➢采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发 效率； ➢利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检 测的灵敏度和特异性； ➢用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数 信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确 性。
此为血细胞分类的 基本原理，但不能分 析表面分子。
单核细胞
中性粒细胞
淋巴细胞
光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
三、荧光测量
• 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激 发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。
• 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过 波长选择通透性滤片，可将不同波Fra Baidu bibliotek的散射光和荧 光信号区分开，送入不同的光电倍增管。
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动
流动室振动
液流断裂成液滴
空白液滴 不充电
弃去
含细胞的液滴 充电
偏转落入收集器
（二）分选的技术要求
• 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬
液中细胞的含量成正比。
• 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞
的百分率。
• 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过
FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
光学系统示意图
Flow Tip
SS and FL Detector
FS Detector
Laser
（3）数据处理系统
主要由计算机及其软件组成
基本工作原理
已标记的单细 硅化管 胞悬液和鞘液
基本过程
流动室 形成稳态 喷嘴 水平激光与之 荧光染料被
单细胞液柱
第四节 流式细胞术在免疫学检查中的应用 一、淋巴细胞及其亚群的分析 二、淋巴细胞功能分析 三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型 四、肿瘤耐药相关蛋白分析 五、AIDS病检测中的应用 六、自身免疫性疾病相关HLA抗原分析 七、移植免疫中的应用
思考题 小结
流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式 细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对 单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分 选的新技术。
1.流式细胞仪的基本结构：
（1） 液流系统 （2） 光学系统 （3） 数据处理系统
（1）液流系统
• 由样本和鞘液组成
• 待测细胞 单个细胞的悬液 抗对其染色 受清洁气体压力 室形成样本流
荧光染料标记的单 从样品管进入流动
• 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是 包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心 位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。
前向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞 时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结 构属性。
侧向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
测得的FS与SS信 号通过计算机处理， 可得到FS-SS图，由 此可仅用散射光信号 对未染色的活细胞进 行分析或分选。
流式细胞仪分析技术及应用
第一节 概述 一、工作原理 二、散射光的测定 三、荧光测量 四、细胞分选原理
第二节 数据的显示与分析 一、参数 二、数据显示方式 三、设门分析技术
第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求 一、免疫检测样品制备 二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色 三、免疫胶乳颗粒的应用 四、流式细胞免疫学技术的质量控制
测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。
• 分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细
胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。 与分选速度成反比。
第二节 数据的显示与分析
• 参数：FS,SS,FL • 数据显示方式 （单参数直方图 、双
流式细胞术的特点
流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及 细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下， 通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种 信号对细胞进行定量分析或纯化分选。
细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量
第一节 概述
流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光 强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析 和分选基础上发展起来的对细胞的物理 或化学性质（如大小、内部结构、DNA、 RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量 并可分类收集的高技术。