拄层析分离色素实验报告

柱层析分离色素

一、【实验目的】

1．了解柱层析的分类，掌握各种柱层析的原理。

2．熟练掌握吸附层析的原理和操作技术。

二、【实验原理】

叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用95%乙醇或无水乙醇提取。

分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。柱层析法是色谱法中的一种，它是根据混合物中各组分对固定相的吸附能力，以及对洗脱剂（即移动相）的溶解度不同将各组分分离。常用的柱色谱有吸附色柱谱和分配柱色谱两类。

吸附柱色谱通常是在玻璃管中填入表面积很大，经过活化的多孔性物质或粉状固体作为吸附剂（如氧化铝或硅胶），当混合物的溶液流经吸附柱时，就被吸附在柱的上端，然后从柱顶加入溶剂（洗脱剂）洗脱。由于不同化合物在吸附柱上的吸附能力不同，在同一溶剂中的溶解度也不同，因此各组分随溶剂以不同速度下移，形成色带。继续用溶剂洗脱，吸附能力最弱的组分就随溶剂首先流出，整个层析过程进行反复的吸附-解析-再吸附-再解吸。用柱层析法可以分别收集各组分，并逐个鉴定。

本实验是把三氧化二铝填入玻璃管中（压成柱状）作为吸附剂，将叶绿体色素的石油醚提取液倾于吸附柱上，色素即被吸附。由于色素的种类不同，被吸附的强弱不同，就在吸附柱上排列成为不同的色层，再利用吸附剂在不同溶剂中有不同的吸附力，用不同的溶剂进行洗脱，从而达到叶绿体主要的4种色素（叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素）的分离。

三、【实验材料】

原料：

新鲜的菠菜叶

试剂：

1．无水乙醇或95%乙醇 5.三氧化二铝

2．石英砂 6．饱和氯化钠溶液

3．丙酮7.水硫酸钠

4．石油醚（60-90℃） 8洗脱液：丙酮：石油醚＝1：9 器材：

层析柱（1×30cm），研钵，蒸馏装置，

脱脂棉，天平，烧杯，过滤漏斗，

玻璃棒，锥形瓶，分液漏斗，试管，

铁架台

四、【实验操作】

1．色素的提取：

20克菠菜，加少许石英砂，再加20毫升无水乙醇研磨成浆，脱脂棉过滤，保存滤液，滤渣再用无水乙醇提取一次，合并滤液，滤渣再加入

30毫升石油醚提取一次，过滤，合并滤液，转移至分液漏斗中,再加入

40毫升饱和氯化钠溶液震荡，弃去下层溶液，再分别加入20毫升水震荡

洗涤几次，直至下层无色，保留上层溶液，转移至三角瓶中，加入无水

硫酸钠干燥5分钟，备用.

2．样品的浓缩：

将提取液放入蒸馏烧瓶中，蒸除多余的石油醚，至剩余液体5-8毫升左右，以备加样使用。

3．层析拄的制备：

15克碱性三氧化二铝加入30毫升石油醚搅拌，浸泡10min.。在层析拄内加入一团棉花在底部，再加入石英砂0.5cm以上，然后用石油醚半充满柱子，再将浸泡好的三氧化二铝倒入柱内，倒时应该缓慢，重复使用下面的石油醚，直到装完。用石油醚洗柱内壁，顶部加一小团棉花，然后

再填入石英砂0.5厘米高。

3．样品的分离层析：吸附层析分离色素

打开层析拄下部开关，向拄内加入2毫升浓缩液，至液体没入砂内，再加入石油醚冲洗拄壁，液体浸入砂内，加洗脱液开始层析，可以看到

不同色带如图片1，直至第一条色带洗脱完毕，在拄下面用试管接收第

一条色带的洗脱液，如图片2。

五、【实验结果】

实验结果如下图：

图一：层析柱中出现黄色带图二：提取出的黄色胡萝卜素

结果分析：

洗脱过程中，首先有一条黄色的色带圈沿着层析柱下移，色带圈的各个方向的移动速度并不是完全相同，原因在于层析柱的制作过程并不完全均一，使层析柱内部不均匀，以至于色带各方向的移动速度不同。最后收集得到亮黄色的胡萝卜素。

七、【注意事项】

1、萃取时不要剧烈振荡，以防止发生乳化现象。

2、为了保持柱子的均一性，使整个吸附剂浸泡在溶剂或溶液中是必要的，否则

当柱中溶剂或溶液流干时，就会使柱身干裂，影响渗透和显色的均一性。因此要保证整个装样过程中溶剂要高于三氧化二铝的表面。

3、在吸附剂上端加入脱脂棉（或滤纸）是使加样品时不致把吸附剂冲起；在吸

附柱下端加脱脂棉（或沙子）可以防止吸附剂细粒流出。

4、层析柱填装紧密与否，对分离效果很有影响，若各部分松紧不匀，会影响渗

透速度和显色的均匀。

6、洗脱流速不宜过快，避免因此压紧凝胶，色素分离不开；也不要过慢，使柱

装得太松，导致层析过程中，凝胶床高度下降，色素洗脱很慢。因此应控制洗脱流速，以每分钟60~80滴为宜。

7、样品一定要足够浓缩，加样量不要过大，过大，分离条带过宽，如果层析拄

不够长，各组分不易分开，易同时洗脱下来；加样量过少，色带不是很清楚，不易观察，效果不好。

8、层析柱粗细必须均匀，柱管大小可根据试剂需要选择。一般来说，细长的柱

分离效果较好。若样品量多，最好选用内径较粗的柱，但此时分离效果稍差。

柱管内径太小时，会发生“管壁效应”，即柱管中心部分的组份移动慢，而管壁周围的移动快。柱越长，分离效果越好，但柱过长，实验时间长，样品稀释度大，分离效果反而不好。

八、【实验小结】

在该柱层析分离色素实验中，我了解了柱层析技术的相应方法和原理，学会了层析柱的制作和准备，进一步了解绿叶中色素的组成及各色素的颜色和性质、洗脱液的配比、层析柱的制作及洗脱液的流速是本实验成功与否的三大关键因素。

知识拓展：

1、溶剂的选择：

（1）吸附剂要求较纯，否则会影响样品的吸附和洗脱。

（2）溶剂和吸附剂不能起化学反应。

（3）溶剂的极性应比样品小，如果大了，样品不宜被吸附剂吸附。

（4）溶剂对样品的溶解度不能太大，否则影响吸附，但也不能太小，溶液的体积增加，易使色谱分散。