DNA的酶切图谱构建与分析

粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端， 粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端， 这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键， 这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键， 所以称为粘性末端。 所以称为粘性末端。
如EcoRI的识别顺序为： EcoRI的识别顺序为： 的识别顺序为 5’…… G’AA|TT_C ……3’ AA|TT_C 3 C_TT|AA’G 3’…… C_TT|AA G …… 5’ 垂直线表示中心对称轴， 从两侧“ 垂直线表示中心对称轴 ， 从两侧 “ 读 ” 核苷酸顺序都是 GAATTC或 CTTAAG， 这就是回文顺序（ palindrome） GAATTC 或 CTTAAG ， 这就是回文顺序 （ palindrome ） 。 _ 和 表示在双链上交错切割的位置， ‘表示在双链上交错切割的位置，切割后生成 5’……G G AATTC……3’、 3、 AATTC
实验七， 实验七，八 DNA限制酶酶切图谱构建与分析 限制酶酶切图谱构建与分析
1. 实验目的和要求 学习和掌握限制性内切酶的特性、 学习和掌握限制性内切酶的特性、酶 解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法.掌握 解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法 掌握 运用限制性内切酶构建大片段DNA图 运用限制性内切酶构建大片段 图 谱原理与技术并理解限制性内切酶是 DNA重组技术的关键工具，琼脂糖凝 重组技术的关键工具， 重组技术的关键工具 胶电泳是分离鉴定DNA片段的有效方 胶电泳是分离鉴定 片段的有效方 法。
琼脂糖凝胶的浓度影响给定大小的线状 DNA的迁移率，因此采用不同浓度的凝 的迁移率， 的迁移率 胶可以分离不同大小范围的DNA片段。 片段。 胶可以分离不同大小范围的 片段 0.8%的琼脂糖凝胶能很好地分辨 的琼脂糖凝胶能很好地分辨1-25kb 的琼脂糖凝胶能很好地分辨 的片段； 的片段；0.5% 的琼脂糖凝胶用于分辨 较大片段的DNA (20-100kb）；对于小 ）；对于小 较大片段的 ）； 片段的DNA(0.2-2kb) 可用 可用1.5%或更高 片段的 或更高 浓度的凝胶进行分离。不过， 浓度的凝胶进行分离。不过，以上这些 并不是绝对的， 并不是绝对的，因为有时我们需要同时 分离多种分子量相差较大的片段， 分离多种分子量相差较大的片段，因此 所用琼脂糖凝胶的浓度要视情况而定。 所用琼脂糖凝胶的浓度要视情况而定。
3） 同裂酶和同尾酶： ） 同裂酶和同尾酶： 同裂酶： 同裂酶：
有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺 序和切割位置都相同， 序和切割位置都相同，其差别只在于当 识别顺序中有甲基化的核苷酸时， 识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种 限制性内切酶可以切割，另一种则不能。 限制性内切酶可以切割，另一种则不能。 例如HpaⅡ MspⅠ的识别顺序都是 HpaⅡ和 例如HpaⅡ和MspⅠ的识别顺序都是 CG_G……3’，如果其中有5’-甲 5’……C’CG_G C CG_G 3 ，如果其中有5 基胞嘧啶，则只有MspⅡ能够切割。 MspⅡ能够切割 基胞嘧啶，则只有MspⅡ能够切割。这 些有相同切点的酶称为同裂酶 同裂酶（ 些有相同切点的酶称为同裂酶（同切酶 或异源同工酶） 或异源同工酶）。
注意：EB是一种诱变剂， 注意：EB是一种诱变剂，操作时一 是一种诱变剂 定要注意安全操作， 定要注意安全操作，必须戴塑料或 乳胶手套。
3. 实验材料与仪器 • λDNA • 标准分子量片段 marker • EcoRⅠ,HindⅢ, BamHⅠ and so on 核酸内 切酶（Takara） 切酶（Takara） • 琼脂糖 • TBE或TAE缓冲液(10×) TBE或TAE缓冲液(10× 缓冲液(10 • 溴化乙啶染色液(10mg/ml) 溴化乙啶染色液(10mg/ml) • 上样液(10×)：0.25% 溴酚兰，40％(W/V) 上样液(10× 溴酚兰，40％ (10 水溶液或30 的甘油。 30％ 蔗糖 水溶液或30％的甘油。
第二类(II型 限制性内切酶能识别专一的核 第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核 (II 苷酸顺序， 苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割 双链。 双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割 的核苷酸都是专一的。因此， 的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内 切酶是DNA 重组技术中最常用的工具酶之一。 DNA重组技术中最常用的工具酶之一 切酶是 DNA 重组技术中最常用的工具酶之一 。 这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4 这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是 4 个或6个核苷酸，少数也有识别5 个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以 10个和 11个核苷酸的 个和11个核苷酸的。 及 7 个 、 8 个 、 9 个 、 10 个和 11 个核苷酸的 。 II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文 对称顺序，即有一个中心对称轴， 对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴 朝二个方向“ 都完全相同。 朝二个方向“读”都完全相同。这种酶的切 割可以有两种方式： 割可以有两种方式：
5) 影响核酸限制性内切酶活性的因素 (1) DNA的纯度； 的纯度； 的纯度 (2) DNA的甲基化程度； 的甲基化程度； 的甲基化程度 (3) 酶切消化反应的温度； 酶切消化反应的温度； (4) DNA的分子结构； 的分子结构； 的分子结构 (5) 溶液中离子浓度及种类； 溶液中离子浓度及种类； (6) 缓冲液的 pH值。 值
1) 寄主控制的限制与修饰现象 2) 核酸限制性内切酶的类型与基本特性 3) 同裂酶和同尾酶 4) 核酸限制性内切酶的命名法 5) 影响核酸限制性内切酶活性的因素
1) 寄主控制的限制与修饰现象
限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。 限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。 各 种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双 种细菌都能合成一种或几种能够切割 双 链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA 链的核酸内切酶，它们以此来限制外源 存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自 存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自 身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了 不受影响， 身的 不受影响 一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限 进行了修饰， 一种修饰酶，对自身的 进行了修饰 制性酶对修饰过的DNA不能起作用。这种现 不能起作用。 制性酶对修饰过的 不能起作用 象被称为寄主控制的限制与修饰现象。 象被称为寄主控制的限制与修饰现象。
2)限制性核酸内切酶的类型及特性 限制性核酸内切酶的类型及特性
按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切 按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切 以及 断核酸的情况不同，分为三类： 断核酸的情况不同，分为三类：
Ⅰ型 Ⅱ型* Ⅲ型
第一类（ 第一类（I型） 限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序 能识别专一的核苷酸顺序， 限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序， 并在识别点附近的一些核苷酸上切割 DNA分子中的双链 分子中的双链， DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸 顺序没有专一性，是随机的。 顺序没有专一性，是随机的。这类限制 性内切酶在DNA DNA重组技术或基因工程中 性内切酶在DNA重组技术或基因工程中 用处不大，无法用于分析DNA DNA结构或克 用处不大，无法用于分析DNA结构或克 隆基因。这类酶如EcoB EcoK等 EcoB、 隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。
EB：即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭 EB： 3,8-二氨基- 乙基溴盐, Bromide)。 溴盐, (Ethidium Bromide)。它能够插 DNA分子中的碱基对之间而与DNA结合 分子中的碱基对之间而与DNA结合。 入DNA分子中的碱基对之间而与DNA结合。 由于EB分子的插入 在紫外光的照射下， EB分子的插入， 由于EB分子的插入，在紫外光的照射下， 凝胶电泳中的DNA条带呈现出红色荧光 DNA条带呈现出红色荧光， 凝胶电泳中的DNA条带呈现出红色荧光， 易于检测。可以检测10ng 的DNA。 易于检测。可以检测10ng DNA。 10
2. 相关基础知识 限制性核酸内切酶： 限制性核酸内切酶 ： 是一类能识别双 分子特异性核酸序列的DNA水 链 DNA分子特异性核酸序列的 分子特异性核酸序列的 水 解酶。 解酶 。 是体外剪切基因片段的重要工 所以常常与核酸聚合酶、 具 ， 所以常常与核酸聚合酶 、 连接酶 以及末端修饰酶等一起称为工具酶。 以及末端修饰酶等一起称为工具酶 。 限制性核酸内切酶不仅wk.baidu.comDNA重组中 限制性核酸内切酶不仅是 重组中 重要的工具， 重要的工具 ， 而且还可以用于基因组 酶切图谱的鉴定。 酶切图谱的鉴定。
同尾酶： 同尾酶：
有时两种酶切割序列不完全相同，但却能 有时两种酶切割序列不完全相同， 产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾 产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾 可以通过DNA DNA连接酶将这类末端连接 酶，可以通过DNA连接酶将这类末端连接 起来，但原来的酶切位点将被破坏， 起来，但原来的酶切位点将被破坏，有时 可能会产生一个新的酶切位点。 Xba1、 可能会产生一个新的酶切位点。如Xba1、 Nhe1、Spe1以及Styl切割的DNA序列不同， Nhe1、Spe1以及Styl切割的DNA序列不同， 以及Styl切割的DNA序列不同 但均给出相同的“CTAG”粘性末端 粘性末端。 但均给出相同的“CTAG 粘性末端。这些 粘性末端连接后，以上的酶将不能再切割， 粘性末端连接后，以上的酶将不能再切割， 但却产生了一个新的4核苷酸的酶切位点， 但却产生了一个新的4核苷酸的酶切位点， Bfa1的酶切位点 的酶切位点。 即 Bfa1的酶切位点。
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后 能形成带有一定孔隙的固体基质的特性， 能形成带有一定孔隙的固体基质的特性，其 密度取决于琼脂糖的浓度。 密度取决于琼脂糖的浓度。在电场的作用下 及中性pH的缓冲条件下带负电的核酸分子就 及中性 的缓冲条件下带负电的核酸分子就 可以向阳极迁移。 可以向阳极迁移。 影响DNA在琼脂糖中迁移率的因素：DNA分 在琼脂糖中迁移率的因素： 影响 在琼脂糖中迁移率的因素 分 子的大小、 的构象、 子的大小、DNA的构象、电压、电场方向、 的构象 电压、电场方向、 碱基组成、 碱基组成、嵌入的染料以及电泳缓冲液的组 成。
4) 限制性核酸内切酶的命名法
用属名的头一个字母和种名的头两个字母 表示寄主菌的物种名称， 表示寄主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表 表 所以用斜体字。 示，所以用斜体字。 用一个字母代表菌株或型， 如流感嗜血菌 用一个字母代表菌株或型 ， Rd菌株用 ，即Hind。 菌株用d， 菌株用 。 如果一种特殊的寄主菌株， 如果一种特殊的寄主菌株 ， 具有几个不同 的限制与修饰体， 则以罗马数字表示， 的限制与修饰体 ， 则以罗马数字表示 ， 如 HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。 Ⅰ Ⅱ Ⅲ
平头末端： 平头末端： II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切 II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切 割双链，产生平头末端。例如EcoRV 割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别 位置是： 位置是： GAT’|ATC 5’…… GAT |ATC …… 3’ CTA’|TAG 3’…… CTA’|TAG …… 5’ 切割后形成 5’…… GAT 3’…… CTA 和 和 ATC …… 3’、 、 TAG …… 5’。 。
二个DNA片段， 3’……CTTAA CTTAA G……5’二个DNA片段，各有 5 二个DNA片段 一个单链末端，二条单链是互补的， 一个单链末端，二条单链是互补的， 其断裂的磷酸二酯键 以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合” DNA连接酶的作用而 以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。
这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。 这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。 DNA连接酶连接起来
第三类（ III型 限制性内切酶也有专一 第三类（ III型）限制性内切酶也有专一 的识别顺序，但不是对称的回文顺序, 的识别顺序，但不是对称的回文顺序,在识 别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切 割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。 割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。 因此， 因此，这种限制性内切酶切割后产生的一 定长度DNA片段，具有各种单链末端。 DNA片段 定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此 不能应用于基因克隆。 不能应用于基因克隆。