植物原生质体游离、培养及应用

植物原生质体游离、培养及应用

摘要:介绍了原生质体培养研究历史,并对植物原生质体游离、培养、植株再生及应用进行了综述。

关键词:植物;原生质体;游离;培养;应用

植物原生质体(protoplast)一词始自Hanstein (1880),即指通过质壁分离,能够和细胞壁分开的那部分细胞物质。按照细胞全能性学说,离体的植物原生质体和其他起源的细胞一样,在合适的离体培养条件下,具有繁殖、分化、再生成完整植株的能力。英国学者Cocking首次用酶法从番茄根尖中游离出大量有活性的原生质体,通过培养再生出细胞壁。以后,人们对原生质体的游离和培养条件进行了广泛的探索,虽未能获得再生植株,但为以后植物原生质体培养的成功奠定了基础。Takebe等首次利用烟草叶片游离原生质体,经培养获得再生植株,使原生质体的研究和应用进入了一个新的阶段。之后,多种植物的原生质体再生植株都相继取得了成功。并且再生植株的数量逐年增加,不仅公认难培养的大豆、棉花可获得再生植株,甚至连以前认为不可能通过原生质体培养再生植株的玉米、水稻、小麦等禾本科植物都相继获得了再生植株。1976年有12种植物的原生质体再生植株, 1983年增至近70种。目前,通过原生质体再生植株的植物已达280种。由此表明,原生质体培养技术已日臻完善,为以后的研究打下了基础。

1.原生质体材料来源及生理状态

原生质体材料的选择影响原生质体的游离效果,也是原生质体培养成功与否的关键因素。游离原生质体的供体取自植物的各类器官、组织、细胞或是由之建立的细胞无性系,它们都相应地反映了材料的某种生理状态。材料的生理状态是影响原生质体游离的诸多因素之一。取自同一植物的不同组织或器官,其原生质体产量不尽相同。在山桃原生质体游离时发现,从悬浮培养物中游离得到的原生质体的产量和活力显著高于从无菌苗叶片和种胚愈伤组织中游离得到的原生质体的产量和活力。

植物及器官、组织的年龄不同,其生理状态也不相同。对于多数植物来说,苗龄和叶龄与原生质体的产量和活力有很大关系。在花生叶片原生质体游离时发现,不同苗龄、叶龄的叶肉细胞原生质体产量有较大差异,苗龄15~25 d的刚平展开的幼叶是游离叶肉原生质体的最佳材料。苗龄对游离决明子叶与下胚轴原生质体的效果也有很大的影响。研究表明, 14~15 d的决明无菌苗的子叶和下胚轴可作为游离原生质体的最佳材料。在苹果原生质体游离时也发现从无菌苗幼叶游离得到的原生质体产量高。

悬浮细胞和愈伤组织的继代时间和继代次数对原生质体的产量和活力有很大影响。从继代3 d的马铃薯悬浮细胞游离出的原生质体的产量高,活力达90%。美味猕猴桃愈伤组织继代第4次时,再培养4 d的愈伤组织所游离得到的原生质体不仅产量高,而且在后期的培养中破碎和解体的少。此外,其他的学者研究也表明,继代时间对原生质体产量有很大影响。

2.原生质体的游离

游离原生质体常用的方法是酶解法。为了得到较高产量和活力的原生质体,在酶解过程中应考虑到以下几方面因素。

2.1酶液组成及浓度

酶的种类和浓度的选择应根据植物材料的来源而定。一般来说幼嫩的叶片、下胚轴等器官为材料游离原生质体时,去壁相对容易,应选用活性较弱的酶,且酶的浓度要低。在以愈

2.2酶解时间

原生质体酶解时应根据酶解液的组成和浓度选择合适的酶解时间。在同一酶解条件下,酶解时间越长,原生质体的产量愈高,但原生质体的活力下降。应尽量降低酶对原生质体的毒害作用,短时间酶解,获取大量有活力的原生质体。草莓花药愈伤组织原生质体游离时,在同一酶解条件下,比较了5个酶解时间(1 h, 5 h, 10 h, 13 h, 14 h),结果发现酶解13 h后,大部分愈伤组织被酶解,且活力达67·35%。在比较酶解4~12 h美味猕猴桃愈伤组织游离原生质体的效果时发现[24],随酶解时间延长,原生质体产量提高,但酶解10h以后,再延长酶解时间,原生质体产量不再增加,且酶解液中碎片不断增多,以8~10 h为宜,获得的原生质体不仅产量高,而且活力强。

2.3酶解方式

一般在游离植物原生质体时,采用在摇床上振荡酶解有利于原生质体的释放。进行野大麦原生质体游离时以80 r/min摇床上酶解,随着振荡时间的延长,原生质体得率不断提高,振荡4 h时得率达最高,为8×106个/g,而在静止条件下酶解4 h时其原生质体得率为3.4×105个/g,仅为振荡4 h时的1/24,在振荡酶解2 h后再静止酶解2 h其得率为7.1×105个/g,为振荡酶解时的1/11。在其他的植物原生质体游离时,也发现振荡酶解有利于原生质体的释放。原因可能是低速振荡增加了酶解液与进行酶解的材料的接触,同时还增加了氧气的供应,对原生质体的释放有利。

2.4酶解渗透压

在游离原生质体时必须注意反应液的渗透压调节,否则游离的原生质体会胀裂。渗透压的调节一般是通过在酶解液中加入渗透剂。不同植物材料游离原生质体时所用的渗透剂种类和浓度不尽相同。不同种类的渗透剂对游离同种植物的原生质体产生不同的效果。在枇杷原生质体游离时发现,甘露醇优于山梨醇。苹果无菌苗幼叶原生质体游离时要求酶液甘露醇浓度为0.7 mol/l。哈密瓜子叶原生质体游离时则要求0.4 mol/L甘露醇的渗透压条件。取同一植物不同部位作为供体,渗透剂浓度仍不相同。Diaz利用辣椒无菌芽游离原生质体时,适宜渗透压为0.7 mol/L甘露醇,而何晓明等进行辣椒子叶原生质体游离时,要求的渗透压为0.5 mol/L甘露醇。

2.5其他因素

原生质体酶解的过程中,还应注意酶液的pH值、酶的纯度、酶解温度等对原生质体游离的影响。近年来,马锋旺等发现在一些果树的原生质体酶解液中加入10 g/L的pvp (聚乙烯吡咯烷酮),原生质体的产量和活力均高于对照。

3.原生质体培养的应用

植物原生质体由于失去了细胞壁这一屏障,因而使其具有特殊的优点,不仅成为植物生理学、细胞生物学、体细胞遗传学等理论研究的理想材料,而且也成为生物工程及作物改良的有效手段。

细胞各种生理现象的研究。采用原生质体培养技术,可了解细胞壁形成的全过程,细胞分裂及细胞分化等。又由于刚分离的原生质体质膜充分暴露,为研究质膜结构,功能及其表面特性提供了方便。对质膜的物质运输,质膜对激素分子,