35药敏试验：K-B法
杀菌动力学
9．测量抑菌环孵育后，手持平皿，从背面目测检查每块平板，用卡尺测量每个抑制环直径(包含纸片的直径)，并以mm为单位记录大小。
10．结果判断参照表6-3—1标准，根据抑菌环大小作出判断，分敏感、中介和耐药三级报告结果。
3. 接种方法将试验菌稀释成107CFU／ml细菌浓度，取一环(约2μg)接种到含有一系列抗生素的琼脂平板上。接种前平板必须相当干燥，从低浓度琼脂平板开始，在30分钟内完成接种，每次试验需点种一个不含抗生素M—H平板以及质控菌株(ATCC．25922)作质控对照。
4. 培养接种好的平板，放置室温让接种液被充分吸干后，置(35±2)℃孵箱内16～20小时，读取结果。
2. 培养基制备M．H琼脂 配制时加水量要减少1／10，以备添加稀释好的抗生素溶液。琼脂培养基经121℃灭菌15分钟，于水浴中冷却至45～50℃；在每个直径9cm平皿中，加 M—H培养基25ml，稀释好抗生素溶液2.5ml，充分混合，制备含有抗生素的琼脂平板，密封在塑料袋，4～8℃冰箱保存，可使用一周。
5．接种菌液制备? ①增菌法：选择琼脂平板上形态相同的菌落至少4～5个，用接种环挑其顶部，移种到4～5ml肉汤或大豆酪蛋白消化液中，35℃培养2～6小时，菌液浓度达 到或超过0.5单位麦氏比浊管浓度，用生理盐水或肉汤校正菌液浓度至与麦氏单位标准比浊管相同[约(1～2)×108CFU／m1]。②细菌直接悬液法： 可直接用过夜培养的菌落在盐水或肉汤中制备接种菌液，浓度调至0.5麦氏单位标准比浊管。
1．纸片扩散法(K—B 法)药敏试验把含有抗菌药物的圆纸片放在均匀地接种了实验细菌的琼脂平板上，抗生素的浓度梯度通过从圆纸片上扩散而形成。试验细菌的生长在圆纸周围一定距 离处被抑制，抑菌圈的大小与细菌的敏感性有直接关系。回归曲线表明MIC的对数与抑菌圈的直径呈直线关系。
药敏试验方法
药敏试验方法药敏试验方法：K-B法：1 从孵育了16-24小时的琼脂平板上（血平板），挑出单个菌落，直接用生理盐水制成0.5麦氏单位。
2 在15分钟内，用无菌棉拭子蘸取调好的菌液，在液面上方管壁处旋转并用力挤压几次，以从中挤出过多的菌液。
3 用棉拭子在无菌的M-H培养基表面化线接种，再重复操作两次，每次将平板转动60度，每次接种都应保证接种物均匀分布，最后用棉拭子涂抹平板的边缘。
4 将确定好的药敏纸片分贴到平板表面。
每个纸片都应压一下，以保证与平板表面完全接触。
每个纸片中心间距24mm。
纸片一旦与平板接触，不应再移动。
5 贴完纸片后，应在15分钟内放入35度孵箱。
嗜血杆菌属，链球菌属放入3%-5%的CO2烛缸。
6 孵育24小时以后，测量各药敏纸片抑菌圈直径，与NCCLS手册比较，作出结果判断。
说明：细菌药敏结果的判断以NCCLS为标准，所以药敏试验的每一步都应严格按照NCCLS操作，否则将失去意义。
链球菌、奈瑟菌属、流感嗜血杆菌、除铜绿假单孢菌和不动杆菌外的假单孢菌属不用K-B 法.肺炎链球菌胶乳凝集测定法1. 在一干净玻片上分别滴两滴生理盐水。
2. 从冰箱取出鉴定试剂(Slidex pneumo-kit)于室温。
3. 在其中一滴生理盐水上滴加R1试剂，在另外一滴上滴加R2试剂，用搅拌棒混匀。
4. 轻轻晃动玻片2分钟，观察结果。
5. 2分钟内，如R1出现凝集为阳性；如R1和R2均未出现凝集为阴性。
注：R3为阳性对照。
药敏纸片的选择1、革兰阴性杆菌（肠杆菌科）头孢噻肟（CTX）头孢唑林（CZ）头孢他定（CAZ）氨苄西林（AM）哌拉西林（PIP）阿米卡星（AN）头孢噻吩（CF）环丙沙星（CIP）头孢呋辛（CXM）庆大霉素（GM）头孢噻肟/棒酸（CTX/CA）头孢他定/克拉维酸（CAZ/CA）羧苄青霉素（CB）奥格门丁（AMX/CA）哌拉西林/三唑巴坦（PIP/TZ）亚安培南头孢匹肟（FEP）头孢克罗（CEC）2、铜绿假单孢菌/不动杆菌妥布霉素（TM）阿米卡星（AN）安曲南（AZT）头孢哌酮（CFP）哌拉西林（PIP）头孢匹肟头孢噻肟（CTX）环丙沙星（CIP）头孢他定（CAZ）左旋氧氟沙星（OFL）亚安培南哌拉西林/三唑巴坦3、金黄色葡萄球菌苯唑西林（OX）青霉素G（P）头孢唑林（CZ）阿米卡星（AN）红霉素（E）头孢噻肟（CTX）环丙沙星（CIP）万古霉素奥格门丁（AMX/CA）哌拉西林/三唑巴坦头孢噻吩（CF）4 、肠球菌氨苄西林（AM）万古霉素环丙沙星（CIP）庆大霉素（GM）红霉素（E）氧氟沙星（OFL）5、除肺炎链球菌外链球菌氨苄西林（AM）头孢噻肟（CTX）万古霉素红霉素（E）氧氟沙星（OFL）克林霉素(CM)肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和大肠杆菌ESBLs的检测MH培养基上贴头孢他定，头孢他定/克拉维酸，头孢噻肟/棒酸，安曲南。
35药敏试验(1)
35药敏试验：K-B法（1）1，M-H琼脂平板厚度：正常应为4mm，当它太厚时，会引起假性耐药，抑菌圈变小。
当它太薄时，出现假性敏感，圈变大。
直径90 mm平板可注入25—30 ml的M—H肉汤，制造好后于4度可保存一周。
2，M-H琼脂平板的PH值：正常应为7.2—7.4,当PH升高时，使青霉素、四环素类的抑菌圈变小，大环内脂类的抑菌圈变大。
当PH降低时，使青霉素、四环素类的抑菌圈变大，氨基糖苷类和大环内脂类的抑菌圈变小。
3，M-H琼脂平板中有胸腺密啶或核苷类物质，当它们的含量增多时，抑菌圈变大。
4，M-H琼脂平板中有钙、镁离子，当它们的含量过高时，引起抑菌圈变小。
当它们的含量过低时，引起抑菌圈变大。
5，纸片含药量：饱和法应为20微克，半饱和法应为10微克。
含药量大则抑菌圈小。
纸片的含药量与纸片的重量、吸水性、直径有关。
纸片的含药量应是每一张都相同。
纸片的PH值应为中性。
纸片的厚度应为1厘米，过厚则抑菌圈变小，过薄则抑菌圈变大。
纸片的直径应为6—6.35 mm，过大引起药物浓度变小,故则抑菌圈变小。
过小，则抑菌圈变大。
纸片于零下20度保存，使用时应室温平衡10分钟以上再打开，注意防潮。
纸片保存不当，引直药量损失，可引起能生长的菌增多，故出现抑菌圈变大。
6，标准菌液的浓度：应为0.5个麦氏浊管，相当于1.5＊108CFU/ml，当过浓时，引起抑菌圈变小。
过稀时，抑菌圈变大。
7，加菌液后，应在15分钟内加药片，不能超过15分钟，否则引起抑菌圈变小。
因细菌已过多的渗透入琼脂中。
8，贴纸片时：纸片间的间距应不小于24 mm，距平板边缘应不小于15 mm。
90mm的平板，要加5片：可防不同药物的相互干扰，防抑菌圈边缘交叉，保持纸片周围浓度相对恒定。
加了一个纸片后，应高温灼烧镊子，再冷却后取下一个纸片。
K-B 纸片扩散法测定抗生素敏感试验
平板霉素类似物生物活性评价平板霉素对耐甲氧西林金葡菌(MRSA)和耐万古霉素肠球菌(VREF)等耐药菌具有很好的抑制活性。
抗菌活性的测试主要针对MRSA和VREF进行测定和相比。
最小抑制浓度（MIC）被确定抑制细菌生长的最低浓度。
通过生物活性数据的反馈，进一步指导平板霉素类似物的合成方向，希望获得活性更高、药效活性更好的抗耐药菌抗生素和药物先导化合物。
纸片扩散法测定抗生素敏感试验及MIC：1.原理：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。
纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后不断地向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制,从而形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度,并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关关系,即抑菌圈愈大,MIC愈小。
2.仪器及试剂仪器：纸片、试管、移液枪、烘箱、培养皿、培养箱、镊子、pH试纸、量筒、天平、高压灭菌锅、三角瓶、打孔器、超净工作台试剂：样品溶液、培养基3.菌液的配置从琼脂平板挑取新鲜分离的菌落数个或从保存的斜面上移种至3～5mL LB肉汤培养液中37℃培养2～8h，以待生长至轻微或中等浊度。
也可直接从孵育18～24h的琼脂平板上挑去纯菌落制成肉汤。
为保证药敏试验的准确度和精度，必须对接种菌液的浓度做相应的控制。
因此，将菌液稀释并校正浊度至0.5麦氏标准浓度，稀释时使用无菌肉汤或生理盐水，此时菌液的浓度约为1.5×108CFU/mL。
4.接种平板在超净工作台中，用量筒量取15mL配置好的灭菌培养基，倒在平板中，冷却凝固。
吸取稀释好的菌液500μL于洁净的灭菌试管中，加入4500μL的培养基，冷却到不烫手，摇匀，均匀倾倒置已凝固的平板表面，放置冷却至凝固。
5.粘贴药敏纸片用纸片分配器或无菌镊子取纸片（直径6mm，厚度1mm），贴于平板表面，并用镊子尖轻压一下纸片，使其贴平。
每张纸片的间距不小于24mm，纸片的中心距平板的边缘不小于15mm。
细菌对抗菌药物敏感性的检验
细菌对抗菌药物敏感性的检验1、扩散法：琼脂加上细菌所需要的各种养料，将培养基融化后，倒入无菌培养皿中，冷却，凝成一个平面或叫平板（平皿）。
这时将含有少数细菌的菌液涂到平板上，培养后细菌就会分别在平皿上繁殖，如果在平皿的培养基内事先加入抗生素纸片，由于药物在培养基中扩散，起了抑（杀）菌作用，形成了不长菌落的抑制圈。
抑制圈的大小，反映某一抗生素对该菌抑菌的程度。
K-B 法：最常用的药敏试验是WHO推荐的Kirby-Bauer纸片扩散法（K-B 法）。
该法将药敏试验抑菌环大小分为四个等级，即：敏感、中度敏感、中介度、耐药。
由于中介度介于敏感和耐药之间，所以不予报告，故化验单上只报告敏感、中度敏感或耐药。
【临床意义】1.敏感：表示被测菌株所引起的感染可以用常用剂量的该抗菌药物治愈，禁忌症除外。
2.中度敏感：表示被测菌株可以通过提高剂量被抑制或在药物被生理性浓集的部位被抑制，如B -内酰胺类药物。
3.中介度：这一范围只是抑菌环直径介于敏感和耐药之间的缓冲域”以防止由微小的技术因素失控所导致的较大的结果解释错误。
抑菌环落入中介度范围，意义不明确，如果没有其他可替代的药物，应重复做药敏试验，或以稀释法测定MIC。
4.耐药：被测菌不能被常用剂量所达到组织内或血液中的抗生素所抑制。
5.最低抑菌浓度：抑制被测菌的最低药物浓度。
6.最低杀菌浓度：抗菌药物杀灭细菌所需的最低浓度。
联合药敏试验：【临床意义】常用于严重感染时对两种或两种以上抗生素的选择。
常用K-B法和方阵棋盘稀释法。
结果以部分抑菌浓度FIC的指数报告。
1.FIC指数v 0. 5,为协同作用。
即两种抗菌药物联合后的药效大于同样浓度的两种药物抗菌作用的总和。
2.FIC指数0. 5〜1,为相加作用，即两种药物联合后其活性等于两种药物抗菌作用的总和。
3.FIC指数1〜2,为无关作用，即联合药物的活性与单独的抗菌作用相同。
4.FIC指数〉2,为拮抗作用，即两种药物联合后的抗菌活性小于单独一种药物的抗菌作用。
K-B法药敏试验结果分析
• 金黄色葡萄球菌：替考拉宁 R/I ，对替 考拉宁耐药的金葡菌至今未见报导。 • 凝固酶阴性葡萄球菌：万古霉素 R/I ， 万古霉素耐药的凝固酶阴性的葡萄球菌 不常见。
罕见的矛盾的结果
• 庆大霉素 R，而苯唑西林 S。太少见，葡萄球 菌对庆大霉素和苯唑西林同时耐药。 • 葡萄球菌：苯唑西林 R，所有氨基糖苷类抗生 素 S，所有喹诺酮类抗生素 S，红霉素 S。这 种情况很罕见，应重新证实苯唑西林结果。 • 葡萄球菌：苯唑西林 S，红霉素 R/I，四环素 R/I，任何林可霉素R/I，则该结果很罕见，对 其它抗生素呈多重耐药的葡萄球菌通常对苯唑 西林耐药。
• J. 志贺菌：所有氨基青霉素 R，所有三代 头孢 S，任何羧基青霉素或任何脲基青霉 素 R/I，说明耐药性可能由获得性β-内酰 胺酶引起，使青霉素和一代头孢菌素的 抗菌活性下降。结果修正为所有青霉素 R，所有一代头孢菌素 R/I。
• K．奇异变形菌、沙门菌：所有氨基青霉 素 R，所有一代头孢和所有脲基青霉素 R/I，所有头霉素 S，任何三代头孢菌素 R/I或头孢泊肟 R，或氨曲南 R/I，说明耐 药性可能由ESBL引起，使青霉素、青霉 素/酶抑制剂、头孢菌素和单环类抗生素 的抗菌活性下降。结果修正为：所有青 霉素 R，所有头孢菌素（除头霉素外） R，氨曲南 R。
• C. 铜绿假单胞菌：替卡西林 R，替卡西 林/克拉维酸 R或派拉西林 R或阿洛西林 R，头孢他啶 S，氨曲南 S。说明耐药性 是由获得性β-内酰胺酶引起。结果修正 为所有青霉素 R。
葡萄球菌
不可能的结果
• 葡萄球菌：青霉素 G S 或β- 内酰胺酶阴 性，苯唑西林 S ，这个结果较罕见，对 青霉素敏感的葡萄球菌不常见到。 • 葡萄球菌：所有抗生素 R，不太可能。 • 葡萄球菌：呋喃妥因 R，葡萄球菌对呋 喃妥因通常敏感。
抗菌药物敏感性试验药敏试验
稀释法
定量测定抗菌药物活性 抗菌药物与肉汤或琼脂培养基混合稀释后
种入试验细菌，孵育过夜。 以能抑制细菌生长的最低浓度为最低抑菌
浓度（MIC） 将MIC与机体血清或体液中可获得药物浓度
相比较来确定恰当的临床疗效
MIC的对数与抑菌环直径关系 ——近似线性负相关
CLSI药物选择原则
A组 常规和首选药物，其结果应常规报告 B组 首选试验选择性报告。包含一些临床
报告方式
常规报告 敏感
菌株能被使用推荐剂量在感染部位达 到的抗菌药物浓度所抑制
中介
被测菌株对该药物的MIC接近于血液、组 织中通常可达到的浓度而治疗反应率可能 低于敏感株。意味着可通过提高剂量或在 药物被生理浓集的部位发挥临床效力。
耐药
被测菌不能被该抗菌药物的常用剂量在组 织或血液内达到的浓度所抑制
磺胺异恶唑
所有菌属
所有磺胺类
萘啶酸（敏感） 肠杆菌科
头孢噻吩/头孢 肠杆菌科 唑啉（敏感）
所有喹诺酮类敏感 所有头孢菌素敏感
万古霉素 氨苄西林
革兰阳性杆菌 肠球菌属
替考拉宁 青霉素
B组药物
细菌对A组同类药物耐药，可选择性报告 报告指征
特定的标本来源 多种细菌感染 多部位感染 对A组药过敏、耐受或无效 以流行病学调查为目的向感染控制部门报告
生长法
挑选琼脂平板上3~5个形态特征一致的 菌落，用接种环接触每个菌落顶部
转移至4~5mL 适宜的液体培养基中 （如胰酶消化大豆胨肉汤）
置35℃孵育2-6 h 用无菌生理盐水或肉汤校正，使其浊度至
0.5号麦氏管
直接调制菌悬液法 生长法的简便替代法
从孵育16-24h 的非选择性琼脂培养基 上用接种环挑取单个新鲜菌落，悬浮 于生理盐水或肉汤中震荡混匀
K-B纸片法
部位感染；⑤感染流行的控制；⑤对A组抗生素
过敏、耐受或无反应。
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9
药敏纸片制备
C组药物用于对A组药物耐药的流行菌株或 对A组药物过敏的病人和某些不常见的细菌 （如肠外分离的沙门菌属或耐万古霉素肠 球菌）。 U组仅用于尿道中分离的细菌，不作为尿道 外分离菌的常规药敏试验。
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17
细菌制备
下表为麦氏比浊管制法：
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18
接种平板
①制备好的接种菌液必须在15min内使用。用灭菌好
的棉试子蘸取菌液，在管壁上旋转挤压几次，去掉过
多的菌液。然后用试子涂布整个培养基表面，反复几
次，每次将平板旋转60°，最后沿平皿周边绕两圈，
保证涂布均匀。
②粘贴药敏试纸
物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）
呈负相关，即抑菌圈越大，MIC越小
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5
第二部分
实验方法
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6
实验方法
培养基制备 药敏纸片制备 细菌制备 接种
Hale Waihona Puke 精选可编辑ppt7培养基制备
培养基的种类： 进行细菌药敏试验所用的培养基种类较多。M—H 培养基 琼脂浓度越大、抑菌圈直径越小。有研究证明3种不同 M—H 培养基进行纸片扩散法，实验结果相同。 浓度1．0 ～ 2．0 、pH 7．4左右 培养基的质量： 4 mm 厚平板，允许±1mm误差，如此控制平板厚度即 可满足试验要求。有研究证明，平板每增厚或减薄1mm， 抑菌圈相应减小或增大0．7mm。
11
药敏纸片制备
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12
药敏纸片制备
微生物学检验(第3版)药物敏感试验
抗生素的种类 一.目的：
四、氨基糖苷类抗生素 按其来源分为：①由链霉菌属发酵滤液提 取获得，有链霉素、卡那霉素、妥布霉素、 核糖霉素、巴龙霉素、新霉素；②由小单 胞菌属发酵滤液中提取，有庆大霉素、福 提霉素；③半合成氨基糖苷类，有阿米卡 星、奈替米星、地贝卡星等。
抗生素的种类 一.目的：
五、喹诺酮类抗生素 第一代为窄谱抗生素，有新恶酸、奈啶 酸和恶喹酸。 第二代为广谱类抗生素，抗菌强度依次 为环丙沙星、氧氟沙星、洛美沙 星、氟咯沙星、培氟沙星、诺氟 沙星。 第三代为超广谱类抗生素，有司帕沙星、 妥舒沙星、左氟沙星等。
纸片的名称，然后用棉试子蘸取菌液，在试管内
壁轻挤去多余菌液后均匀涂布于整个平板表面3次， 每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂一周。放 置约5分钟后用镊子分别挟取所选择的药敏纸片贴 上。室温放置10分钟左右，恒温箱培养24h。
验操实作
• (4)、MH平板涂布均匀，放置5分钟再贴纸 片，纸片放置应该迅速准确，不得在平板 上拖动纸片，纸片间的距离和位置要均匀。 离平板边缘不小于15mm，两纸片间距离不 小于24mm。
实验原理 1.原理：
实验操作（接种与培养）
• (1)、取待测菌平板，观察菌落形态，涂片镜检， 革兰阴性杆菌做氧化酶试验，革兰阳性球菌做触 决定选择何组、何种药敏纸片。
酶实验。并根据实验结果对该菌株作出初步判断，
药敏试验选择纸片
• 触酶阳性的G＋球菌：青、苯唑、克林、庆大、环
丙沙星、万古、红霉素、头孢唑林 庆大、环丙沙星、万古
(一）苛养菌药敏试验抗生素的选用
A组一级试验并常规报告的抗微生物药 , 如肺炎链球菌用红霉素和青霉素。 B组一级试验有选择报告的抗微生物药 , 如肺炎链球菌用头孢噻肟或头孢曲松 。 C组补充试验有选择报告的抗微生物药， 如肺炎链球菌用头孢呋辛 。
怎样做好药敏试验（K-B法）
怎样做好药敏试验（K-B法）近年来，细菌感染性疾病严重威胁着人类的健康，抗生素的合理使用是治疗和控制此类疾病的有效手段，抗生素体外药敏试验结果的正确与否对抗生素的选择至关重要，药敏试验的结果受到诸多因素的影响，如培养基、试纸片以及菌液的浓度等。
1、培养基细菌药敏试验所用的培养基种类较多，多数情况下，采用WHO 组织统一要求的M-H培养基，这种培养基中含有的低胸腺嘧啶是与磺胺类药物竞争的物质，因此进行的药敏试验效果较好。
此外，还有适量的Ca2+、Mg2+，在培养基中起到触媒的作用。
但是，有些细菌对培养基中的成分有特殊的要求，特殊的菌要用特殊的培养基才能进行药敏试验。
例如，流感嗜血杆菌的药敏试验培养基用HTM琼脂；淋球菌的药敏试验培养基用加5％羊血的巧克力M-H琼脂；肺炎链球菌的药敏实验用M-H琼脂加5％的脱纤维羊血培养基。
培养基中还有适量的Ca2+、Mg2+，在培养基中起到溶酶的作用，其含量的变化，可影响氨基糖苷类和四环素对铜绿假单胞菌的试验结果，含量过高，抑菌圈会变小，含量过低，抑菌圈会大得不可接受。
细菌药敏试验的培养基厚度大约为4mm，若培养基厚度大于4mm，会使细菌出现耐药；若小于4mm，本应耐药的易出现敏感。
所以，试验时一定不要把药敏纸片放在中央部位，而应均匀地排布在平皿周围的培养基上。
制作药敏试验的培养基用水，主要是Ca2+、Mg2+等矿物质离子，也在很大程度上影响着药敏试验的结果。
2、试纸片试纸片材质的好坏，对药物稳定性和活性有很大影响。
加工药敏试纸片的试纸一般是使用加厚型的滤纸，杂质少，对药物保存无太大影响。
然而，临床中很多用的是普通纸，被水浸润后会呈碱性，并且含有大量无机离子，因此使用普通纸加工的试纸片药物有较大的影响。
药敏纸片的PH值一般要求为中性，这样才适合药的活度。
药敏纸片的厚度要求大约1mm，这样才有利于细菌的生长和药物的扩散速度。
药敏纸片的直径在6.00～6.35mm之间，纸片的厚度和直径大小都会影响药敏试验的结果。
纸片扩散法药敏试验
纸片扩散法药敏试验纸片扩散法（K-B法）药物敏感试验是在涂有细菌的琼脂平板培养基上按照一定要求贴浸有抗菌药的纸片，培养一段时间后测量抑菌圈大小，并根据相关解释标准进行结果分析，从而得出受试菌株药物敏感性的结论。
中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论目录.1试验原理.2试验步骤.3结果分析.4注意事项基本信息中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论试验原理纸片扩散药敏试验的原理：将含有定量的抗菌药物的纸片贴在接种有待测菌的固体培养基上，通过抗菌药物在培养基上的扩散，观察是否出现抑菌环，推断是否抑制细菌的生长。
药物扩散的距离越远，药物浓度越低抑菌能力越强，因此可根据抑菌环的大小，判定药物对细菌的抑制作用强弱。
试验步骤1. 待测菌株接种物制备（1）通用情况：从过夜孵育的平板，优先选择哥伦比亚血琼脂平板上的菌落上挑取数个单个菌落，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。
（2）特殊情况：嗜血杆菌属（本程序中所指的嗜血杆菌仅包括流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌）：从过夜孵育的HTM平板，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。
2.接种平板（1）调整好悬液的浊度后，用无菌棉签浸入悬液内，紧贴试管内壁在液体上方旋转拭子数次，除去棉签上多余的液体，但也应适度。
（2）用拭子划线整个琼脂表面，从平板顶部到底部，均匀涂布，重复两次此过程（一共三次）每次旋转平板约60度，确保每次接种菌液均匀分布，最后在琼脂平板的边缘涂抹一圈，防止有流动的菌悬液，并使菌液涂布于整块平板的每个角落。
（3）涂布菌液完成的平板，可在室温放置一会（3-5分钟），以便在放置含有药物的纸片前使琼脂吸收表面多余的水分，但放置时间不应超过15分钟。
作业指导书-K-B纸片琼脂扩散法药敏试验操作
操作顺序
检查要点
使用材料
1、试验操作前，提前把单人净化工作台的紫外灯打开，杀菌一个小时；
2、配制MH（A）培养基，121℃高压灭菌15min，取出后在净化工作台中倒入无菌平皿中，每个平皿倒入20ml左右，使培养基厚度约4mm左右；晾干后备用；
3、在净化工作台中进行试验操作，用移液枪取校正好的菌液100μl注入已制备好的MH培养基上，用玻璃涂棒涂抹均匀；
检查要点
使用材料
1）取定性滤纸，用打孔器打成直径为6mm的圆形纸片，放入清洁干燥的青霉素空瓶中，瓶口以单层牛皮纸包扎，经121℃高压灭菌30min后，放在60℃的烘箱中烘干备用；
2）试验操作前，提前把单人净化工作台的紫外灯打开，杀菌一个小时；药液配制方法参照CLSI抗微生物药物敏感性试验执行标准（2010版）中规定的配制；药液配制在净化工作台中进行；
操作安全
1.高压锅使用时禁止脱水操作、排气未尽时不要打开高压锅；2.所有带菌实验用品，须经有效的消毒灭菌处理后再洗刷。严禁污染下水道。
环境要求
外围：一般பைடு நூலகம்境
无菌操作：万级局部百级洁净
异常处理
1.操作过程中断电，已打开的物品应重新灭菌，以防污染；2.发现污染及时处理；3.操作仪器有异常，及时汇报并报修。
3.纸片在使用前1～2h从冰箱取出，暖至室温再打开，以避免出现冷凝水。纸片启封后应放入可密封的有干燥剂的容器中，纸片只能在有效期内使用，过期应弃去。
1.打孔机、手提式高压蒸汽灭菌锅、恒温干燥箱、电子天平；
2.无菌水、磷酸缓冲盐溶液等溶剂
3.新华定性滤纸
材料处理
1.将材料2及圆纸片放入高压锅，按高压蒸汽灭菌锅操作规程操作，灭菌121℃、30分钟；
临床微生物学检验理论课：04药敏试验+合理用药
PK/PD简介
PK/PD 研究是把PK与PD结合起来研究药物剂量相 对应的时间-浓度-效应关系，可以反映药物-人 体-病原体之间的关系。
PK/PD简介
时间依赖性抗菌药物(time dependence antimicrobial agents，简称TDAA)。
质控结果记录错误； 量取抑菌环时读数错误； 标准菌株被污染或变异； 接种的菌悬液浓度不准确；
常见失控原因
0.5麦氏单位，标准比浊管未摇匀或已过期失效； 培养环境不正确； MH平板质量问题； 药敏纸片保存温度不当或过期等导致失效。
（二）MIC法药敏试验
MIC稀释法药敏检测
MIC稀释法一般在琼脂或肉汤中将抗菌药物系列对倍 稀释，定量接种待检菌， 35℃培养18至24小时后观 察结果；
二、临床合理使用抗菌药物
（一）CLSI M100-S22药敏试验解读 （二）临床常用抗菌药物种类及合理使用 （三）PK/PD参数与抗菌药物合理使用
CLSI规定，肠球菌引起的全身性严重感染，常 联合应用β-内酰胺类和氨基糖肽类抗生素，如果肠 球菌对高浓度庆大霉素耐药，则联合用药无效。
耐万古霉素肠球菌（VRE） 再用E-test法验证； 如发现VRE，则应注意对相应病人做好隔离，以 防医院感染扩散。
肺炎链球菌耐青霉素（PRSP） 用本唑西林纸片监测； 如耐药表明对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、 头孢克肟、头孢唑肟疗效很差。
疗效低于敏感菌株。
还表示药物在生理浓集的部位具有临床效力（如尿 液中的喹诺酮类和β-内酰胺类），或者可用高于正 常剂量的药物进行治疗（如β-内酰胺类）。
另外，中介还作为缓冲区，以防止微小的、未受控 制的技术因素导致较大的错误结果，特别是对那些 药物毒性范围窄的药物。
K-B纸片扩散法药敏试验技术要点
2.3菌液的接种量细菌接种量是药敏试验结果产生较大差的原因之一，余修中[3]在K-B纸片扩散法药敏试验菌液量的规范研究中提出固定接种0.35ml菌液量的规范。到目前为止，NCCLS推荐使用的是采用无菌棉拭子蘸取调好的菌液，在液面上方管壁处旋转并用力挤压几次，以从中挤出过多的接种菌液。然后在琼脂表面均匀涂布接种3次，每次将平板转动约60度，最后用棉拭子涂抹琼脂的边缘，对接种菌量未做客观要求。鉴于上述情况，建议在进行药敏试验用棉拭子涂布时，尽量保证选用同一品牌、大小相同的棉拭子，以减少误差，确保药敏试验的准确可靠。
3培养基
3.1培养基的选择药敏试验中，为保证结果重复性及抑菌环的大小清晰，应选择对抗生素及磺胺药物无拮抗剂的培养基。水解酪蛋白（Mueller-Hinton,MH）培养基是CLSI推荐采用的需氧菌和兼性厌氧菌药敏试验标准培养基，PH为7.2-7.4，临床实验室常规敏感试验，除了检测容易生长的在M-H培养基的需氧、兼性厌氧菌外，尚有许多不能在M-H培养基上生长或生长不良的菌株。如链球菌属、流感嗜血杆菌及淋病奈瑟菌。培养基内必须补充特殊的营养成份。流感嗜血杆菌应选用嗜血杆菌试验培养基（HTM）[4]；肺炎链球菌和其他链球菌所用培养基是在M-H琼脂中加5%脱纤维羊血。
[3]余修中，K-B法药敏试验中菌液量的规范[J],四川省卫生管理干部学院学报，2002.9（21）：177.178.
[4]王传新、王国礼，现代检验医学技术及质量控制[M]，济南，山东科学技术出版社，204:171.
快速K-B法细菌药物敏感试验抑菌环直径改变规律及对判断结果的影响
快速K-B法细菌药物敏感试验抑菌环直径改变规律及对判断结果的影响王恒秋;刘雨峰;王双;胡志方【摘要】目的探讨快速K-B法细菌药物敏感试验(antibiotic susceptibility test,AST)抑菌环直径改变的规律以及对判断结果的影响.方法收集我院2013年1月-2014年9月分离自门诊和住院患者的菌株865株,其中金黄色葡萄球菌109株,其他葡萄球菌218株,大肠埃希菌139株,其他肠杆菌302株,铜绿假单胞菌26株,其他非发酵菌71株.采用快速K-B法进行AST,菌株的菌龄分别为≤48 h,72 h,96 h 及≥120 h,于进行AST后2h,2.5 h,3h,3.5 h和4h测量抑菌环改变情况,并进行统计学分析.结果 6类细菌的抑菌环直径改变率差异无统计学意义(P＞ 0.05);相同菌龄的不同菌种抑菌环直径改变率差异均无统计学意义(P均＞ 0.05).相同菌种不同菌龄的菌株抑菌环直径改变率差异均有统计学意义(P均＜ 0.05),不同菌种相同观测时间的抑菌环直径改变率差异均无统计学意义(P均＞0.05).同一菌种不同观测时间的抑菌环直径改变率差异均有统计学意义(P均＜ 0.05).不同菌种的抑菌环直径改变率在相同观测时间的分布差异均无统计学意义(P均＞ 0.05);而同一菌种的抑菌环直径改变率在各观测时间的分布差异均有统计学意义(P均＜ 0.05).结论细菌抑菌环直径的改变率与菌种无关,与菌龄相关,抑菌环直径改变对AST判断结果基本无影响.【期刊名称】《实用检验医师杂志》【年(卷),期】2014(006)004【总页数】4页(P223-226)【关键词】快速;K-B法;细菌;抑菌环;药物敏感试验;菌龄【作者】王恒秋;刘雨峰;王双;胡志方【作者单位】512031 韶关市,韶关市中医院检验科;512031 韶关市,韶关市中医院检验科;512031 韶关市,韶关市中医院心内科;512031 韶关市,韶关市中医院检验科【正文语种】中文细菌药物敏感试验（antibiotic susceptibility test，AST）对临床合理使用抗生素、细菌耐药的监测以及研究细菌耐药的机制意义重大。
35药敏试验：K-B法
35药敏试验：K-B法（2）9，温育时间为16—18小时，时间过长，则被抑制的菌又生长，引起抑菌圈变小。
时间太短，则细菌尚不能被完全抑制，圈则变大。
10，操作：A：取出平板要先在35度的温箱中放置30分钟，以除去水分。
不是于室温中放置！不能立即用来接种！B：均涂布接种3次，每次旋转平板60度，最后要沿平板内缘涂一次才行。
C：涂好细菌后，平板要于室温中放置3—5分钟等待干燥，再贴纸片。
（目的：等细菌完全吸收）注意：是在室温中放，不再是像平板刚取出时于35度的温箱中放置。
涂布细菌后不能立即贴纸片。
D：纸片的贴法：各纸片的中心距≥24 mm，纸片与平板内缘则应距离≥15 mm。
直径90 mm平板贴6张。
E：纸片贴好后不能移动，要室温放置15分钟后，倒置于35度的温箱中，于16—18小时后观察结果。
培养时间变长，则原已被抑制的细菌又生长，抑菌圈变小。
时差变短则抑菌圈变大因菌未能被抑杀。
G：细菌接种的方法：是作涂布法，不是划线法！11，结果判断：要在黑色无反光的背景下测量包括纸片直径在内的抑菌圈直径。
（在红细胞渗透脆性试验中则是白色背景）测量抑菌圈：抑菌圈的边缘是以肉眼看不见细菌生长为准。
一般要从背面测量。
但是培养基加有血液时，则要打开平板盖，借助反射光从正面测定。
12，结果解释：敏感（S）：常规剂量的药物有体内达到有效浓度时，可抑制或杀灭体内的被检菌。
中介（I）：叫缓冲区。
以防止细小的技术误差引起结果的偏差。
它的意义不确定，一般不作报告。
耐药（R）：常规剂量的药物有体内达到有效浓度时，不能抑制或杀灭体内的被检菌。
A：细菌检验的室内质量控制中，对质控菌株的保存要求是：在4度、大豆酪蛋白消化液琼脂上保存，每周传代一次。
B：对常用的质控菌株，要求每月更换一次。
C：一批新的抗菌药物，应用质控菌株每天检查一次。
纸片扩散法药敏试验
纸片扩散法药敏试验纸片扩散法（K-B法）药物敏感试验是在涂有细菌的琼脂平板培养基上按照一定要求贴浸有抗菌药的纸片，培养一段时间后测量抑菌圈大小，并根据相关解释标准进行结果分析，从而得出受试菌株药物敏感性的结论。
中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论目录.1试验原理.2试验步骤.3结果分析.4注意事项基本信息中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论试验原理纸片扩散药敏试验的原理：将含有定量的抗菌药物的纸片贴在接种有待测菌的固体培养基上，通过抗菌药物在培养基上的扩散，观察是否出现抑菌环，推断是否抑制细菌的生长。
药物扩散的距离越远，药物浓度越低抑菌能力越强，因此可根据抑菌环的大小，判定药物对细菌的抑制作用强弱。
试验步骤1. 待测菌株接种物制备（1）通用情况：从过夜孵育的平板，优先选择哥伦比亚血琼脂平板上的菌落上挑取数个单个菌落，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。
（2）特殊情况：嗜血杆菌属（本程序中所指的嗜血杆菌仅包括流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌）：从过夜孵育的HTM平板，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。
2.接种平板（1）调整好悬液的浊度后，用无菌棉签浸入悬液内，紧贴试管内壁在液体上方旋转拭子数次，除去棉签上多余的液体，但也应适度。
（2）用拭子划线整个琼脂表面，从平板顶部到底部，均匀涂布，重复两次此过程（一共三次）每次旋转平板约60度，确保每次接种菌液均匀分布，最后在琼脂平板的边缘涂抹一圈，防止有流动的菌悬液，并使菌液涂布于整块平板的每个角落。
（3）涂布菌液完成的平板，可在室温放置一会（3-5分钟），以便在放置含有药物的纸片前使琼脂吸收表面多余的水分，但放置时间不应超过15分钟。
影响K-B法药敏试验结果因素
影响K-B法药敏试验结果的因素[摘要]细菌的耐药性和抗生素的合理使用是全球广泛关注的问题.其中细菌对抗生素敏感试验（以下简称药敏试验）在延缓和控制细菌耐药性、合理使用抗生素方面发挥着重要作用，是临床合理用药的重要依据，为确保其结果的准确性，必须了解试验中培养基种类及质量、试验用药的纯度和菌液的浓度、药物的含量及孵育时间等诸多因素的影响。
[关键词]细菌；药敏试验；琼脂；药片；室内质控细菌感染性疾病严重威胁人类的健康，抗生素的合理使用是治疗和控制此类疾病的有效手段，其中抗生素体外药物敏感试验（以下简称药敏试验）结果的正确与否对抗生素的选择至关重要，而药敏试验会受到诸多因素的影响，如培养基种类及质量、试验用药的纯度和菌液的浓度、药物的含量及孵育时间等。
纸片法药敏试验是将抗菌药物吸收到特定的纸片中，然后置于已接种待测定菌的固体培养基上，抗菌药物通过向培养基内的扩散，抑制敏感细菌的生长，从而出现抑菌圈.抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（mic）呈负相关关系，即抑菌圈愈大，mic愈小。
本文就k-b纸片琼脂扩散法中的影响因素加以阐述，以提高药敏试验结果的准确性，为临床合理用药提供可靠依据。
1培养基对药敏试验的影响首先应根据试验菌的营养需要选择适宜的培养基。
培养基的成分的不同，不仅影响敏感菌株的生长繁殖并可影响到抑制圈的直径。
who要求统一使用muellerhinton（m-h）琼脂作为纸片法药敏试验的常规用培养基，该培养基中含有的低量胸腺嘧啶或胸腺嘧啶核苷是与磺胺类药物和甲氧苄啶竞争的物质，若过量可能会逆转磺胺类和甲氧苄啶的抑菌效应，使得抑菌圈变小变模糊，甚至消失，从而导致假耐药报告。
培养基中还有适量的钙，镁离子，在培养基中起到溶酶的作用，其含量的变化，可影响氨基糖苷类和四环素对铜绿假单胞菌的试验结果，含量过高，抑菌圈会变小，含量过低，抑菌圈会大得不可接受。
一般细菌，如大肠杆菌及葡萄球菌可使用普通营养琼脂；做磺胺类药物敏感试验时应选用无蛋白胨平板；链球菌和巴氏杆菌可用绵羊血琼脂平板。
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35药敏试验：K-B法（2）
9，温育时间为16—18小时，
时间过长，则被抑制的菌又生长，引起抑菌圈变小。
时间太短，则细菌尚不能被完全抑制，圈则变大。
10，操作：
A：取出平板要先在35度的温箱中放置30分钟，以除去水分。
不是于室温中放置！不能立即用来接种！
B：均涂布接种3次，每次旋转平板60度，最后要沿平板内缘涂一次才行。
C：涂好细菌后，平板要于室温中放置3—5分钟等待干燥，再贴纸片。
（目的：等细菌完全吸收）注意：是在室温中放，不再是像平板刚取出时于35度的温箱中放置。
涂布细菌后不能立即贴纸片。
D：纸片的贴法：各纸片的中心距≥24 mm，纸片与平板内缘则应距离≥15 mm。
直径90 mm平板贴6张。
E：纸片贴好后不能移动，要室温放置15分钟后，倒置于35度的温箱中，于16—18小时后观察结果。
培养时间变长，则原已被抑制的细菌又生长，抑菌圈变小。
时差变短则抑菌圈变大因菌未能被抑杀。
G：细菌接种的方法：是作涂布法，不是划线法！
11，结果判断：
要在黑色无反光的背景下测量包括纸片直径在内的抑菌圈直径。
（在红细胞渗透脆性试验中则是白色背景）测量抑菌圈：抑菌圈的边缘是以肉眼看不见细菌生长为准。
一般要从背面测量。
但是培养基加有血液时，则要打开平板盖，借助反射光从正面测定。
12，结果解释：
敏感（S）：常规剂量的药物有体内达到有效浓度时，可抑制或杀灭体内的被检菌。
中介（I）：叫缓冲区。
以防止细小的技术误差引起结果的偏差。
它的意义不确定，一般不作报告。
耐药（R）：常规剂量的药物有体内达到有效浓度时，不能抑制或杀灭体内的被检菌。
A：细菌检验的室内质量控制中，对质控菌株的保存要求是：
在4度、大豆酪蛋白消化液琼脂上保存，每周传代一次。
B：对常用的质控菌株，要求每月更换一次。
C：一批新的抗菌药物，应用质控菌株每天检查一次。