液氮研磨提取组织RNA步骤

液氮研磨组织提取RNA步骤

一、试剂与耗材（RNA提取专用，无RNase）

75%的酒精（用无酶水配制），RNase Zap，Trizol(Invitrogen)，氯仿，异丙醇，无RNA酶水（Ambion）；研钵，研杵，1.5ml EP管，

2.0ml EP管，15ml 管，50ml 管，棉纱布。

二、操作步骤

1)用75%酒精对实验操作台、移液枪、枪头盒、管架进行消毒，

然后再用RNase Zap擦拭上述材料。

2)取出-80℃冰箱保存的组织块，放于用液氮预冷过的研钵中，敲

碎一小块组织，其余放回冻存管。

3)加入液氮，先轻轻敲碎组织到最小块，再研磨成粉末，直到看不

到组织块。

4)加入液氮使粉末凝聚成团，马上用药勺把粉末转移到2.0ml EP

管中。

5)待液氮挥发干后，加入1ml Trizol裂解液，用1ml移液器将细胞

吹散开，保证细胞裂解充分，必要时可借助水平振荡器混匀。6)4℃离心机12000rpm离心5分钟,弃沉淀。注：此时可放入-80℃

低温冰箱长期保存。

7)加入氯仿，比例200ul氯仿/ml Trizol，颠倒混匀，室温放置15

分钟。

8)于4℃离心机12000g离心15分钟。取上清液（上层为水相，

中间层为蛋白，下层为有机相，核酸分子主要集中在上层），注意吸取上清是无触碰到中间层或下层。

9)取上清液（上层为水相，中间层为蛋白，下层为有机相，核酸分

子主要集中在上层），注意吸取上清是无触碰到中间层或下层。

10)加入等体积异丙醇，-20℃沉淀1小时。

11)于4℃离心机12000g离心10分钟。

12)弃上清，加入1ml 75%酒精漂洗沉淀，于4℃离心机800g离心

5分钟。必要时可重复酒精洗涤

13)弃上清，可选择再次离心去除残留的乙醇，沉淀在安全柜内晾干，

切忌过干，只需目测乙醇挥发干即可。

14)根据沉淀的大小，使用无RNA酶的水将RNA沉淀充分溶解。

选择溶解沉淀的体积，一般为30-100ul。测RNA浓度，此方法RNA A260/A280值在1.6-1.8之间。

15)电泳检测RNA完整性，0.5XTBE Buffer,110V 电泳30分钟。

16)最后将沉淀保存在-80℃低温冰箱。