Western blot实验步骤详解PPT

合集下载

WESTERNBLOT操作步骤图PPT课件

WESTERN BLOTTING 过程图解
1
图中绿色的是夹玻璃片的架子
2
玻璃板对齐后放入架中，把两侧的夹子卡紧。要使短玻璃靠外，长玻璃靠内。
3
然后垂直卡在架子上准备灌胶。操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。图示两块玻璃板放在一个架子上。
4
配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液
33
将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中
34
室温下脱色摇床上摇动封闭1h。 35
按所需稀释浓度滴加一抗（直接加在封闭液里）4℃ 过夜或37℃ 3h。
36
第二天取出膜，用TBST洗三次每次10min，然后加入TBS液中，按稀释浓度滴加二抗。室温孵育1h,再用 TBST洗三次每次10min。最后DAB显色或者化学发光法显影。
封时要很慢，否则胶会被冲变型。）
5
当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等 3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。按前面方法配4％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
6
16
电泳时间一般1-2 h，电压为100V较好，也可用60V。电
泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳。
17
取出转移槽
18
2020/3/6
可编辑修改
19
取下玻璃板
20
两块玻璃板都已经取下

western-blotting(蛋白免疫印迹)PPT课件

.
20
膜的选择
1. PVDF膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。
2. PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。大于20KD的蛋白选用0.45um的膜，小于20KD的蛋白选用0.2um的膜。
1.含HRP的抗体； 2.发光试剂； 3.反应的杂质;
.
27
洗脱抗体
一抗洗脱二抗洗脱一抗种属来源不同时，strip二抗即可
.
28
三、显色
暗室曝光 Tanon 5200 全自动化学发光图像分析系统
.
29
Tanon 5200---性能特点
适用于高分辨率和高灵敏度的图像拍摄；
可设定连续采样的次数、起始及终止曝光时间，进行动态连续拍摄，拍摄得高质量的图片；
在裂解液中加入合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准
确性！ .
7
蛋白样品的制备
① SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
② 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫键，破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 胶束。
对
电转仪长期使用导致海绵变薄，
策
“三明治”结构不紧凑导致。
确保膜和胶块之间没有气泡
缓冲液中离子浓度太低，电流或电
压太高。转膜过程注意降温
.
34
四、SDS-PAGE常见问题
背景太高
原因
1. 膜没有均匀浸湿 2. 膜或者缓冲液污染 3. 封闭不充分 4. 抗体与封闭剂出现交叉

Westernblot实验技术培训课件

5. 抗体浓度过高
4. 杂交前检测一抗、二抗的
工作浓度
Westernblot实验技术
24
没有阳性条带或比较弱
原 1. 抗体染因色不充分
2. 靶蛋白含量太低 3. HRP抑制剂 4. 转膜时间不够 5. 曝光时间过短
1. 增加抗体滴度，延长孵育
时间
2. 增加样本上样量
对 3. 所用溶液和容器中避免含
Westernblot实验技术
21
条带比正常的窄？
“微笑”或“倒微笑” 条带？
➢ 凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓
➢ 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲
➢ 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度
➢ 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适
快速、特异，信号弱、昂贵 Westernblot信实验号技术强、二抗选择多，非特异性结合3
Western Blot一般流程
蛋白样品的制备
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色
Westernblot实验技术
4
蛋白样品的制备
Westernblot实验技术
5
裂解液
➢ 只能识别非变性的抗原表位的抗体，不能选择SDS及强去污剂的裂解液 ➢ 研究蛋白之间相互作用，应选择温和非变性裂解液 ➢ 对于难溶解蛋白，应选用裂解强度更高的裂解液（如RIPA, SDS)
Westernblot实验技术
29
Western Blot基本原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
快速、特异，信号弱、昂贵 Westernblot信实验号技术强、二抗选择多，非特异性结合30

Westernblot操作流程ppt课件

蛋白印迹杂交—— Western blot
张蕾
Western blot的原理
利用抗原抗体的免疫反应，先将蛋白通过SDSPAGE电泳分离开来，然后再利用电场力的作用将胶上的蛋白转移到固相载体（NC膜或 PVDF膜）上，然后再加抗体形成抗原抗体复合物，利用增强化学发光法或生色底物呈色反应将结果显示到膜或底片上。从而对目的蛋白进行定性和半定量分析的一种检测蛋白的方法
抗体的选择
显色或显影
印迹用酶联二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶纯化底物生成有颜色的产物时，就会出现可见的区带，即指示目的蛋白的位置
酶联的二抗：辣根过氧化物酶体系(HRP)：DAB显色或化学发光试剂显影（ECL）碱性磷酸酶体系(AP)： BCIP+NBT显色
ECL试剂采用氧化还原反应的原理：利用二抗上标记的过氧化物酶或辣根过氧化物酶，在 H2O2的存在下，使底物(化学发光物质鲁米那) 发生氧化还原反应，从而发出荧光。
组织中总蛋白的提取 0.1g加入0.8ml RIPA（强）裂解液用干净的剪刀将组织块尽量剪碎后匀浆
蛋白质含量的测定
考马斯亮兰染色法(CBB法，Bradford法)
原理：考马斯亮蓝(CBB)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质—色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
成像
关于内参
内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。

westernblot详解PPT课件

蛋白质Marker
➢主要目的是确定靶蛋白的分子量大小；使用预染的Marker还可以实时检测电泳分离情况，并可以转移到膜上。
Fermentas
Prestained protein ladders Unstained protein ladders
第29页/共53页
上样缓冲液 Loading buffer
第6页/共53页
第7页/共53页
一配分离胶
准备物品：玻璃板洗衣粉灌胶架移液枪两个烧杯（ 1 ml 200ul 20ul） 30%Acrylamide 1M （4度冰箱）， Tris-HCL 溶液（ PH=8.8）， ddH2O 10%AP （-20冰箱）， TEMD（4度），SDS（常温） 1 清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用ddH2O冲洗干净后立在通风处或烘箱中 2 配制分离胶：玻璃板对齐后放入夹中加紧，注意使两玻璃板对齐。然后垂直卡在架子上准备灌胶。先配制分离胶。配方如下：
1.将200mg组织块剪碎，置于1ml裂解液中（
5ml离心管）。
2.匀浆器进行匀浆，注意冰上操作，匀浆后置于
冰上。
3.10，000g ,4℃,10min,（5ml管）离心
4.取上清至1.5ml管，12，000g ,4℃,60min,
离心
5.取上清至新1.5ml管,-80℃储存
第22页/共53页
3·1·2 蛋白样品浓度的测定方法
第18页/共53页
3·1 固定
①用ddH2O水冲洗一下玻璃板，将其放入电泳槽中。注意，小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。
②向电泳槽中加入1x电泳液
• 5X电泳液缓冲液 ③Tr拔is（掉M梳W子1，2注1.1意4动）作轻柔。

《westernblot讲解》PPT课件

K和ɑ为常熟，de为蛋白质移动距离，do为小分子示踪物的移动距离。
22
精选课件ppt
TEMED即N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 中文名字是N,N,N',N'-四甲基二乙胺。用于配制PAGE胶等。TEMED可以催化过硫酸铵
从而产生自由基，从而加速丙烯酰胺凝胶的聚合。注意事项：易燃，有腐蚀性，请注意防护。易挥发，使用后请盖紧瓶盖。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套,戴口罩操作。
24
精选课件ppt 25
19
精选课件ppt 20
图像分析
精选课件ppt
将胶片扫描或拍照，用凝胶图像处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
21
注释
精选课件ppt
SDS为十二烷基硫酸钠，它是一种阴离子表面活性剂，与蛋白质结合成复合物，使不同的蛋白质带上相同离子的负电荷，从而消除蛋白质之间原有的电荷差异。SDS为一种变性剂，能破坏蛋白质分之中的氢键和疏水键、巯基乙醇能打开二硫键。蛋白质在电泳中的迁移率D和分子量M成对数关系。IgM=K-ɑde/do=K-ɑD
试剂。
8
精选课件ppt
仪器：电转移装置（实验室为Bio-Rad公司装置）高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、-20℃低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。
9
样品制备
精选课件ppt
样品制备包括单层贴壁细胞总蛋白的提取、组织总蛋白的提取、加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取。
含量测定
电泳
转膜
免疫反应
化学发光
图像分析
7
试剂及仪器准备

Western-blot实验方法步骤PPT教学课件

• 超声打碎染色体DNA,直至溶液不粘为止。 • 4度，13000rpm，30分钟离心。分成三层：上
层为油脂，中层为蛋白质，下层为沉淀。 • 有必要时重复上一步骤。 • 上清用于做SDS-PAGE，如不能立即做，可将上
清转入另一Eppendorf -80°C保存
注意事项
• 细胞裂解液的量 • 超声的频率，时间，次数。插得深不起泡
沫。 • 检测蛋白的敏感性1－5ng,0.75mm厚的
SDS－PAGE的一个孔大约上100ug的总蛋白。 • 只要被检测蛋白占总蛋白的1/100000,即可被检测。 • 未知蛋白应同时作阳性对照。
主要试剂
• RIPA（华舜公司） • 苯甲基磺酰氟PMSF（华舜公司） • 丙烯酰胺（Amresco公司） • 双丙烯酰胺（Amresco公司） • 丽春红染料（华舜公司） • Tween 20（Amresco公司） • 过硫酸铵（Sigma公司） • 四甲基乙二胺TEMED（Sigma公司） • 硝酸纤维素膜（Amersham公司） • 考马斯亮兰（Fluka公司） • 兔抗大鼠Glut 1多克隆抗体（Santa Cruz公司） • Phototope-HRP Western Blot Detection System（Cell Signaling
• 被广泛地用于蛋白质研究，基础医学和临床医学的研究。
溶解蛋白策略
• 1 使用剧烈的条件以确保细胞蛋白能全部裂解下来，但这可能导致免疫反应性的丢失。
• 2 采用温和的条件以助于保持蛋白质的天然状态，但这造成蛋白质从细胞上的脱落效果欠佳。
• 机械破碎细胞，可释放出蛋白酶从而使靶蛋白降解。细胞表面蛋白和分泌蛋白通常比细胞内蛋白具有更好的抵抗力，变性蛋白比天然蛋白更容易降解。

western blot原理及操作方法ppt课件

常见问题
8.二抗的选择根据一抗的种属来源，如：一抗是兔抗大鼠目的蛋白的抗体，则二抗应选择山羊或其他来源抗兔的抗体，而且二抗要标记有同位素或酶。 9.条带两边扩散：加样量过多 10.条带两边高，中间凹原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好; 电泳系统温度偏高
常见问题
11.条带呈皱眉状，中间高，两边低原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全 12.条带有拖尾现象原因：样品溶解不好 13.混合搅拌速度时不宜太快，容易产生气泡影响聚合，导致电泳带畸形。太慢不均匀，特别是甘油
常见问题
3. 加入分离胶后，立即覆一层双蒸水，一是为了使分离胶界面保持水平，用水就可以把它压平，使蛋白质分子跑时在同一水平线上；二是阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。也可以覆盖一层无水乙醇。
常见问题
4. 从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。 5.膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路 6.电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温 7.切滤纸和膜时，一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜
主要试剂
13.封闭缓冲液封闭膜上的非特异性蛋白结合位点，防止一抗、二抗的非特异性反应 • TBST Buffer 100 mL • 5 % Nonfat Milk 5g 14.一抗 15.二抗：羊抗兔IgG/HRP（辣根过氧化酶）使试剂中的发光物氧化并发光 16. ECL检测试剂
操作步骤
提取总蛋白
主要试剂
8.10×转印Buffer（贮存液） 4℃保存 • 10×转印Buffer（贮存液）的配制： • 0.25 M Tris 30.28 g • 1.92 M Glycine 144.13 g • 三蒸水定容至 1000 mL • 1×Transfer Buffer（工作液）： • 10×Transfer Buffer 100 mL • 三蒸水 700 mL • 20 % 甲醇 200 mL

蛋白质免疫印迹实验(Western-BlotPPT课件

硝酸纤维素薄膜和六层Whatman 3MM滤纸，在硝酸纤维素薄膜左下角剪去一角作为标记。将硝酸纤维素薄膜漂浮于去离子水的表面，使水从膜的下部浸透以去除其间气泡，将Whatman 3MM滤纸在电转移缓冲液中浸湿，用蒸馏水淋洗石墨电极，先将三层浸湿的滤纸放在阳极上，在滤纸表面滚动玻璃棒以除去其间的气泡，再将浸湿的硝酸纤维素薄膜小心平铺在滤纸上，用玻璃棒小心去除气泡。随后将12%SDS-PAGE凝胶舒展平铺在硝酸纤维素薄膜上，用玻璃棒小心去除气泡，再将三层浸湿的滤纸平铺在凝胶上，沁心去除气泡，最后加上石墨电极板，接通电源进行电转移，电流的大小由凝胶的大小决定，为0.65mA/平方厘米。电转移2小时后，停止通电，卸掉电转移装置，取下凝胶进行考马斯亮兰染色，以检测电转移是否完全。小心取下硝酸纤维素薄膜，放在一张干滤纸上，吸干30-60分钟后，开始进显色反应。
蛋白质免疫印迹实验
（Western Blotting）
.
1
一实验原理
Western Blotting 是用来检测蛋白质的一种技术。
首先将含有待测蛋白的蛋白质混合物进行凝胶电泳分离，然后将已经分离的蛋白质通过电泳技术从凝胶转移到固体支持物上，这一固体支持物目前常为硝酸纤维素薄膜。随后以待测蛋白质上抗原决定簇特异性的抗体（称为第一抗体）为探针，与固体支持物上的蛋白质进行免疫反应，最后用偶联有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶的抗第一抗体的抗体（第二抗体）与第一抗体进行免疫反应，只有与第一抗体特异性结合的待测蛋白才能与第二抗体发生免疫反应。在有辣根过氧化物酶的底物用显色剂存在时就会出现颜色反应，结合有第一抗体、第二抗体的待测蛋白，通过颜色反应即能显现出来。
缓冲液在室温下封闭2小时，同时1：100加入兔抗GST

Wesern-bloing蛋白免疫印迹实验ppt课件

子时要使梳子保持水平。）
④ 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，
槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）
27
清洗玻璃板
配胶
上样
电泳
停止电泳
①测完蛋白含量后，计算含50mg蛋白的溶液体积即为上样量。适量蛋白加入4：15*Loading Buffer于离心管，100℃水中煮5min使蛋白变性。放置冰上3min，离心15min，13000rpm，4℃。
2.结果分析
3.注意事项
四
实验室常见问题解答
20
蛋白样品制备蛋白含量测
定
21
在六孔板中，按照一个孔添加150μL的比例添加适量RIPA裂解液，用枪吹打均匀以充分接触细胞。
样品放置冰上 30min（中间混匀5-6次）直至裂解完全。
充分裂解后，1000014000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作
②加足够的1*电泳缓冲液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气
泡也可能使样品溢出。）
28
清洗玻璃板
配胶
上样
电泳
停止电泳
浓缩胶80V电压跑20 分钟，可多跑几分钟；分离胶180V电压跑至底端。
疾病早期诊断
例：诸延慧，容瓘等.酶联免疫印迹术(EITB)在小鼠日本血吸虫感染早期诊断中的应用[J]. 中国人兽共患病杂志,1993,9(3):26-29.
5
检测样品中特异性蛋白质是否

Western blot 实验原理和实验步骤 PPT

1
Western blot 基本原理
蛋白免疫印迹的组成
Western blot 一般流程
Western blot 常见问题分析
Western Blot基本原理
WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，
“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。SDS-PAGE可对蛋白质
样品进行分离，转移到固相载体——例如PVDF膜上。固相载体可
滤纸，擀几下盖上阴极盖子。整个操作在转膜液中进行，要不断的擀去气泡。
（5）将盒子放入转膜槽中，转膜时会产热，打开电源，设置mA 和时间转
膜时间。
转膜条件
11
ห้องสมุดไป่ตู้
推荐：25V，1.0A，25min。（适合本实验室半干转移条件）
转膜注意事项：滤纸、胶、膜之间不能有气泡产生滤纸、胶、膜的大小和摆放顺序胶和膜上要做好标记，识别正反面和上下 PVDF膜需要100%甲醇预处理，后续操作中膜必须保持湿润
以吸附蛋白质，并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
转移后的PVDF膜就称为一个印迹（blot），用蛋白溶液（如
5%BSA或脱脂奶粉溶液）处理，封闭PVDF膜上的疏水结合位点。
用目标蛋白的抗体（一抗）处理PVDF膜——只有待研究的蛋白质
1
才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。用一抗处理过
小心剥下分离胶，并根据胶的大小裁剪同样大小PVDF膜，剪去膜的左上角作为
标记。如果样本多，同时做几张膜，可用铅笔在膜下角标ABCD或1234，这样可
以分出膜的正反和加样顺序。
注意：裁滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。

Western blot 实验介绍及流程PPT课件

ECL显色：ECL试剂与过氧化物酶结合后发光后，可用仪器自动检测或在暗室内用 X-光片将其记录下来。
第13页/共17页
Western blot 实验结果与分析
将X-光片在凝胶图像分析仪上进行灰度扫描，比较目的蛋白与内参照蛋白的灰度值，可得到蛋白表达半定量分析结果
c-fos actin
62kD 42kD
二抗孵育：二抗的选择根据一抗的种属来源，如：一抗是兔抗大鼠目的蛋白的抗体，则二抗应选择山羊或其他来源抗兔的抗体，而且二抗要标记有同位素或酶。
第12页/共17页
Western blot 实验流程
6 ECL detection ECL Kit is based on the enzyme-linked immunodetection of antigen-specific antibody using anti-IgG secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase ( HRP ), which reacts with a chemiluminescent substrate in the presence of a chemical enhancer.
• 电泳仪
用途：用于生物学实验中对特定目的蛋白质的分离，定性及定量的检测分析，是Western-blot（蛋白免疫印迹）实验中非常重要的部分。
第2页/共17页
Western blot 实验原理
• Western blot是利用已知的特异性抗体与抗原（即组织细胞中的目的蛋白）能特异性结合的原理，通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂（如酶、金属离子、同位素）显示一定的颜色或发光来对组织细胞内目的蛋白定性及半定量的研究。