southern印迹杂交基本方法及主要步骤

基本概念及原理

Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DN A片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量[1][2]。

基本方法及主要步骤

Southern印迹杂交的基本方法包括四部分，以下以植物southern印迹杂交为例。

（1）植物基因组DNA提取；

（2）DNA的限制性内切酶酶解、电泳和Southern转移；

（3）探针的标记和纯化；

（4）杂交、洗膜、检测以及去除膜上探针。

主要操作步骤：

1．琼脂糖电泳

（1）取一定量的待测DNA样品，用适当的限制性内切酶酶切。DNA的量根据样品的种类及实验目的的不同而异，对于克隆片段的限制性内切酶图谱分析，取0.1-0.5μg即可；而对于鉴定基因组DNA中的单拷贝基因序列，则需要10～20μg；当采用寡核苷酸探针或探针的比放射性活性较低时，则需要30～50μg。

（2）酶切完毕，在琼脂糖凝胶中电泳。

（3）电泳结束后，EB染色，长波紫外线下观察电泳结果及照相。

2．印迹转移

（1）切胶并作标记（左下角切除），以便于定位，然后将凝胶置于一容器中。

Southern印迹杂交转膜示意图

（2）将凝胶浸泡于适量的变性液中，室温下放置1h 使之变性，不间断地轻轻摇动。

变性缓冲液：1.5mol/L Nacl

0.5 mol/L NaOH

（3）将凝胶用去离子水漂洗1次，然后浸泡于适量的中和液中30 min，不间断地轻轻摇动。更换中和液，继续浸泡15 min。

（4）将滤纸，硝酸纤维素膜NC膜(以下简称NC膜）剪成与胶同样大小，NC膜浸入转移buffer中平衡30 min。

（5）按右图操作：逐层铺平，各层之间勿留有气泡和皱折。

（6）虹吸转移12-16h。

转膜液： 1.0mol/L Nacl

0.4 mol/L NaOH

3．固定DNA

碱性转移不需要固定，在中性缓冲液中室温15分钟。

(1.0mol/L Nacl 0.5 mol/L Tris-Cl 1)

（1）取出转移后的NC膜，用滤纸吸干NC膜，NC膜光面朝上平铺于变性液中变性5min。

（2）用相同的方法将NC膜平铺在中性液上，中和两遍，每遍5min。

（3）将膜夹在两张干燥滤纸间，80℃烘烤1-2h。

4．预杂交

（1）将膜浸入5×SSC 中2min，将膜放入干净的塑料袋中。

（2）将预杂交液事先在65℃预热，然后将10 ml 预杂交液加入袋中，封口。

（3）65℃预杂交1h 以上，不时摇动。

5．杂交

（1）取出杂交袋，剪去一角去除杂交液后，加入5ml杂交液及5μl 变性探针，排除气泡后封口。

（2）将杂交袋放入65℃水中杂交过夜。

6．按下列条件洗膜

（1）剪开杂交袋，用镊子取出膜，放入装有20mL的2×SSC 0.1% SDS溶液的平皿中，在室温下振荡洗涤两次，每次5分钟。

（2.）用镊子将膜转入0.1×SSC，0.1% SDS溶液(先放50℃水浴预热)中，50℃水浴振荡洗涤两次，每次15分钟。

（3）用镊子将膜取出转入装有20mL洗涤缓冲液的平皿中振荡洗涤5分钟。

7．信号检测

（１）所需试剂：

请按下表组分准备所需试剂。

（２）制备试剂盒工作液

（３）流程：在培养皿上进行信号检测。

注意: 所有孵育过程应在15-25°C下搅动进行，如果膜要用于再杂交，则不要让膜在任何时候变干。