实验五 细胞显微操作技术

实验五细胞显微操作技术

一．【实验目的】

1、练习针刺细胞（未受精卵、去卵核、早期胚胎细胞或体外培养细胞）

2、练习微吸管制备；

3、了解显微移植技术（细胞核、外源基因）

4、了解显微注射的应用及注意事项。

二.【实验原理】

显微注射（microinjection）技术是利用显微操作系统和显微注射技术将外源目的基因直接注入到受精卵的原核中，使外源基因整合到受体细胞的基因组内，再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体动物的子宫内发育，从而获得转基因动物。它是目前基因转移效率较好的一种基因转移方法，可直接用不含有原核载体DNA片段的外源基因进行转移；外源基因的长度不受限制, 可达100kb ；实验周期相对比较短。

核移植的机理

供体细胞的细胞核移入卵母细胞后，在卵母细胞相关因子的作用下，发生了重编程回复到发育的起点状态。核重编程的过程就是使在体细胞中被关闭，而在正常胚胎发育中表达的基因重新被激活的过程

重编程有三种可能的结果

（1）供核基因组完全没有进行重编程，重构胚很快死亡；

（2）部分重编程，重构胚在不同的发育阶段死亡；

（3）完全重编程，产生正常的克隆动物。

外源基因导入（基因沉默、过表达、转基因动物）

利用显微操作系统将外源目的基因（DNA或RNA）直接注入到受体细胞或受精卵的原核中，使外源基因整合到受体细胞的基因组内，培养/筛选，获得转基因动物/性状分析；显微注射是目前基因转移效率较好的一种基因转移方法，可直接用不含有原核载体DNA片段的外源基因进行转移；外源基因的长度不受限制, 可达100kb；实验周期相对比较短。它的不足之处是：需要昂贵精密的设备；显微注射操作复杂；导入外源基因整合位点和拷贝数无法控制；常导致插入位点附近宿主DNA 片段缺失、重组等突变，可造成动物严重的生理缺陷。

三.【实验器材及材料】

斑马鱼Danio sp.胚胎、倒置显微镜；显微操作仪；拉针仪、酚红

四.【实验步骤】

注射针内装液

（1）使用无菌的微量加样器从微注射针的后部加入待注射样品；

注射针安装和定位

（1）将装液后的针头的游离端安在连接器上，然后旋紧连接器以固定针头，再将其固定到微操作仪的托针管上；

（2）把载有待注射样本的培养皿放在显微镜载物台上，用低倍物镜对准细胞调焦；

（3）移动针头并在显微镜下调整微操作仪，直到针头的阴影在视野的中心上方；

（4）使用工作用放大倍数，调准细胞焦距，找到针尖。

显微注射

（1）使针尖对准细胞的待注射部位（细胞与针尖在同一焦面上），旋转推进旋钮，针刺入细胞内（卵膜、细胞膜、核膜）；

（2）旋转加样旋钮，将样本加入，并离开细胞。

五．【实验结果】

注射前注射中注射后

六【注意事项】

在实验过程中，断针时针头应断成尖锐状，既对胚胎有保护作用也容易进入胚胎。断后的针应放在铺有海面或泡沫的平皿里，防止针滑动而被碰断。在整个过程中，注射针尖应远离人员和实验室中的仪器。注射针在持针器上安装不牢时，注射器、管子及注射针内的压力，可能将注射针射出。在反向充填液体时，适当地在显微镜下观察注射针尖，以决定在加压时是否注射针阻塞或偏斜。阻塞通常可通过将针尖轻轻敲击一个固定物而得以缓解。针尖偏斜的注射针是适合于显微注射的，但其使用应做细微调整或补偿注射中加压所造成的额外偏斜。注射速度过快能扰乱细胞质成分，细胞裂解或细胞从底层移位。当注射体积小于估计的细胞体积的10%，并且注射样品的流动速度几乎不导致可见的细胞质移位时，注射效果最好。