外源基因的原核表达

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大肠杆菌基因表达载体
6、密码子：密码子有简并性，多个 密码子为一个氨基酸进行编码，不 同生物在利用这些密码子时其利用 频率不同，不同的密码子会影响到 大肠杆菌的翻译速度。
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基因表达的机制
基因工程技术的核心是基因表达技术。 迄今为止，已构件建了不同类型的表达 系统，可根据需要合理地选择适当的表 达系统。
• 3、宿主本身杂蛋白质多，纯化步骤复 杂。
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大肠杆菌基因表达载体
理想的大肠杆菌表达载体的特征 1、稳定的遗传和复制能力，在无选
择压力下保存于大肠杆菌细胞内 2、具有显性的转化筛选标记 3、转录可以调控，抑制时本底转录
水平较低 4、转录的mRNA能够在适当的位置
终止且转录不影响载体的复制 5、具备适用于外源基因插入酶切位
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目的：在细胞生长的初期不表达或低 水平表达，当细胞增殖到一定的密度 时，在某种特定的诱导因子的诱导下
启动转录合成mRNA。
诱导型 启 原核生物启动子 组成型
动
子
诱导型 真核生物启动子
组成型
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mRNA的延伸与稳定性： 有效表达的关键是：保持mRNA的 1、有效延伸 2、正确终止 3、mRNA在细胞中的稳定存在
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mRNA的有效延伸：导致mRNA转 录提前终止的可能原因有和解决办 法
1、衰减子：类似于简单的终止子， 在原核生物中一般位于操纵子的启 动子与第一个结构基因之间。在构 建表达载体时应避免该序列的存在。
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2、非特异终止：防止非特异性终止 的方法是在构建表达载体时加入抗 终止的序列元件。
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原核生物基因表达系统的特点： 4、不具备真核生物的蛋白质加工系 统，表达产物无特定的空间构象。 5、内源蛋白酶会降解表达的外源蛋 白，造成表达产物的不稳定。
由于以上特点，近年来真核生物表 达系统发展很快，并构建了相应的 基因表达载体。
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大肠杆菌表达系统
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转录的正确终止也是外源基因有效 表达的重要因素，可以防止产生不 必要的转录产物，使mRNA的长度 限制在一定的范围内，从而增加外 源基因表达的稳定性。 原核生物解决办法 真核生物解决办法
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mRNA在细胞中的稳定存在：mRNA在 受体细胞中的稳定存在直接决定翻 译产物的多少。解决办法
外源基因在受体细胞中的表达包括：
1、转录 2、翻译
两个环节
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基因表达的机制
基因工程的核心问题：有效表达 外源基因表达的关键步骤：起始转录 基因表达的限速步骤：转录起始的速率 构建表达系统时首先要考虑的问题是： 1、选择可调控的启动子 2、相关的调控序列
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常用的原核外源表达系统
大肠杆菌表达系统 芽孢杆菌表达系统
链霉菌表达系统 蓝藻表达系统
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原核生物基因表达系统的特点：
1、原核生物大多数为单细胞异养， 生长快，代谢易于控制，可通过发 酵迅速获得大量基因表达产物。 2、基因组结构简单，便于基因操作 和分析。 3、多数原核生物细胞内含有质粒或 噬菌体，便于构建相应的表达载体。
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大肠杆菌基因表达载体
3、启动子：是与DNA依赖的RNA 聚合酶相结合的一段DNA序列。启 动子是调控外源基因转录的重要顺 式作用元件，与mRNA的合成有很 大关系，是表达载体不可缺少的元 件。
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大肠杆菌基因表达载体 4、终止子：在转录过程中能在特异 位点将转录终止的DNA序列。有两 种类型
大肠杆菌表达系统是基因表达技术 中发展最早，目前应用最为广泛的 经典表达系统。属革兰氏阴性细菌。 其特点是：
遗传背景清楚
目的基因表达水平高
培养时间短
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大肠杆菌表达系统的主要不足
• 1、缺少真核生物的蛋白质翻译后修饰 和加工过程。
• 2、表达的蛋白质多以包含体形式存在， 需经复性才能恢复构象与活性
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终止子的功能
（1）、能能有效控制目的基因 mRNA的长度
（2）、提高mRNA的稳定性
（3）、避免载体上其他基因的异常 表达
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大肠杆菌基因表达载体
5、核糖体结合位点：原核细胞 mRNA蛋白合成起始点上游的一段 非编码序列。能与30S小亚基中16S rRNA3’末端的一段序列特异结合。 此序列富含嘌呤，核心序列为SD序 列。
点
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大肠杆菌基因表达载体构成
1、复制子：是一段包含起始位点和 反式因子作用区在内的DNA片段。 其功能是通过复制使载体稳定存在 于大肠杆菌细胞。
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大肠杆菌基因表达载体
2、筛选标记：大肠杆菌经过转化后， 仅有少数细菌能获得携带外源基因 的质粒并稳定地传代，筛选标记可 有效地筛选出转化有外源基因的阳 性重组。
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外源基因表达的作用：外源基因表达泛指 目的基因与表达载体重组后，导入合适的 受体细胞，并能在其中有效表达，产生目 的基因产物。外源基因的表达是研究和探 索基因功能、基因表达调控机制、编码蛋 白质的结构与功能的重要方法，也是制备 和生产新型蛋白质药物、诊断试剂必不可 少的手段。通过外源基因的表达可由宿主 细胞产生大量的目的蛋白。
1、ρ－因子型终止子
2、转录产物二级结构
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大肠杆菌基因表达载体 4、终止子： 能在特异位点终止转 录的DNA序列。终止子有两种类型
1、ρ－因子
2、转录产物二级结构
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1、原核生物：选择一个RNase缺失 的工程菌株。
2、真核生物：提高mRNA的正确加 工
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外源基因mRNA的有效翻译 为使外源基因有效翻译，在构建表