肿瘤分子标记物检测

肿瘤分子标记物检测

随着我国社会经济的发展和人民生活方式的改变，老龄化趋势越来越明显，恶性肿瘤已成为我国重要的健康问题，是我国男性的头号杀手，在女性中仅次于心脏病和脑血管疾病。近年来，肿瘤药物治疗得到长足发展，临床医生根据指南以及药物的临床试验，对肿瘤患者采用标准化的治疗方案，但其有敏感率低，超过半数的肿瘤患者出现耐药，而且大部分起初有反应者最终也出现耐药，不仅给病人造成巨大的浪费，也延误了肿瘤的治疗时机。

得益于高通量分子生物学技术广泛应用，药物基因组学及肿瘤分子生物学研究迅猛发展，对于肿瘤多成因、异质性的特点有了更加全面的认识，同时也为我们从恶性肿瘤的综合治疗由标准化过度到个性化指明了方向。个体化治疗已经成为肿瘤临床治疗最有效的手段，但如何识别具有相同肿瘤发生部位、相同病理类型及病期的不同患者之间存在的差异成为实施个体化治疗的主要障碍。大量的临床研究和试验结果表明：特异肿瘤分子标记物是识别患者个体差异的重要依据，实现对这些分子标记物的检测是实施肿瘤个体化治疗的前提和基础。

用于识别肿瘤患者个体差异的分子标记物大致可归纳为三类：1）抗肿瘤药物的作用分子标记物，如HER2和EGFR；2）抗肿瘤药物代谢相关的分子标记物，如UGT1A1和CYP2D6等基因多态性；3）抗肿瘤药物作用通路的相关分子标记物，如KRAS基因突变和ERCC1基因mRNA表达水平。越来越多的证据显示，抗肿瘤药物作用通路的相关分子标记物是识别患者个体差异的最主要分子标记物。例如，约百分之三十携带了EGFR基因突变的非小细胞肺癌患者使用针对EGFR的TKI药物无效，其原因之一是患者存在其他分子标记物的改变；再如，KRAS基因野生型的肠癌患者接受抗EGFR抗体药物单药治疗疗效仍然有限，也是因为其他分子标记物的变化，如BRAF基因激活突变。随着抗肿瘤药物的不断增加以及研究的深入，与作用通路有关的分子标记物越来越多。检测也从以前的单一分子标记物发展为多分子标记物联合进行。通过针对不同癌种的系统分子标记物检测，筛选适合患者个体的药物，提高治疗的针对性和有效率。

肿瘤治疗能否真正实现“个体化”，最终还要依赖于分子标记物检测的结果是否准确可靠。如何确保分子标记物检测结果的准确可靠是目前实施肿瘤个体化治疗面临的最大挑战。根据分子标记物的不同可将主要的检测分为两大类：

一、体细胞突变和基因多态性

1. 体细胞突变

人体正常细胞经过一系列基因突变，最终摆脱细胞正常生长调控而癌变。这些体细胞突变除了与肿瘤细胞恶性程度、侵袭性等特征有关外，部分体细胞突变会影响药物疗效，如上文及的肿瘤细胞EGFR基因突变

2. 基因多态性

个体间基因组差异至少在15％，正是这种差异造成了不同个体间生物学性状、疾病易感性、药物效应个体差异。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是人

类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上。其主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，并藉此改变基因的表达、翻译和蛋白质功能，从而产生对疾病易感或药物效应差异的表型。SNP已成为第三代遗传标志,人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关。

借助于遗传变异，理论上我们可以预测个体对某一药物的反应，但由于涉及到药物剂量最优化、降低毒副作用、提高疗效和降低成本等因素的影响，这种预测结果的准确性较为相对。药物代谢、药物转运和药物靶体等功能性基因的SNP均会影响药物的疗效。如：5-FU 是目前肠道等恶性肿瘤的基本化疗药物之一，临床应用较广。已知二氢嘧啶脱氢酶基因（dihydropyrimidine dehydrogenase gene，DPYD）编码5-FU代谢限速酶——二氢嘧啶脱氢酶（Dihydropyrimidine dehydrogenase enzyme，DPD）。但DPYD缺陷性等位基因造成DPD酶活性完全缺失，无法代谢5-FU，故当使用5-FU 时毒副作用会较大，甚至危及生命。

肿瘤组织体细胞突变涉及染色体核型、基因扩增、基因缺失、点突变等。对于基因扩增或缺失，目前临床上常使用FISH技术。而对于更大的染色体改变，可直接用传统的核型分析即可。对于短片段突变（包括SNP）检测的金标准是测序，相较于mRNA和蛋白检测方法，测序更为简单、准确。另一方面，除了基因扩增和缺失外，所有SNP/突变不涉及量的改变，因此其检测结果可真实反映患者或其肿瘤组织的遗传本质。

二、组织mRNA和蛋白表达

恶性肿瘤的治疗效果不仅跟患者本身的遗传背景相关，而且与肿瘤组织的遗传学改变（体细胞突变）密切相关。尽管发现了众多的肿瘤遗传学改变，事实上目前只有少部分的发现应用于肿瘤的分子分型和治疗（如EGFR突变）。肿瘤组织体细胞突变，最终会导致其基因/蛋白表达水平的异常改变。因此尽管对于这些遗传学改变功能不明确，我们仍可通过基因/蛋白表达水平来获得肿瘤组织的生物学信息。目前肿瘤组织基因/蛋白表达已开始应用于临床实践。如：在最近发布的美国国家癌症综合治疗联盟（NCCN）非小细胞肺癌的临床治疗指南（第二版，2009）中明确指出：“在接受铂类化疗前进行ERCC1 mRNA表达水平检测可提高治疗有效率和患者生存率”；与乳腺癌不良预后相关的基因表达谱预测标记物已被美国FDA批准用于临床。

1.蛋白表达与免疫组化（IHC）

肿瘤组织蛋白表达水平，目前临床上多采用IHC技术。IHC法是用应用免疫学抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。尽管IHC是一个常规的很简单的分子生物学技术，但由于涉及的实验步骤较多，其中任何一个步骤操作不当，均会影响结果的准确性。美国有一项调查显示，IHC检测HER2蛋白过表达的错误阳性率平均为18%，而FISH检测HER2基因扩增的错误率在13%。影响IHC 结果准确性的最大因素在于试验前期的各项工作，其中最为重要的影响因素是固定，而病理