第六章分子荧光分析法

分子的去激发过程 使分子从基态跃迁到激发态的辐射称为激发光。
分子被激发到较高的能级后不稳定，将以不同途径释放
多余的能量回到基态，这个过程即为分子的去激发过程。 去激发过程包括下面几个可能的途径： （1）振动弛豫、（2）内转换、（3）荧光发射、 （4）外转换、（5）系间跨跃、（6）磷光发射
二、激发光谱与荧光光谱
T
Tmax
1/2Tmax

0
带通型滤光片
T
Tmax
1/2Tmax
t

截止型滤光片
三 样品池 通常用石英制成，因为荧光有紫外区的，普 通玻璃会吸收。 样品池为四面透光的方形石英池。 四 检测器 用光电管或光电倍增管作检测器。新一代荧 光光谱仪中使用了电荷偶合元件检测器，可一次 获得荧光二维光谱。
I0 F
C b
I
3、F = K’ I0 1 － 10 -abc 当abc<0.05，I0一定时 F=KC 此式仅适用于低浓度的情况，此时荧光强度 与溶液浓度关系曲线为一直线。
4、内滤效应和荧光猝灭效应
当浓度增大至一定限度时，荧光强度与溶液浓度关系曲线 将弯向浓度轴。 曲线弯曲的原因是多方面的，主要是由于内滤效应和荧光 猝灭效应等造成的。 内滤效应是指样品浓度过大时，使荧光在未射出样品池之 前就被溶液中未被激发的荧光物质所吸收（自吸收）而引起 的荧光强度随浓度下降的现象。 样品浓度越大，内滤效应越显著。 荧光猝灭效应，即荧光分子与溶剂或其他溶质分子之间相 互作用，使荧光强度减弱的现象。能引起荧光强度降低的物 质称为荧光猝灭剂。荧光猝灭包括动态猝灭和静态猝灭。
1、激发光谱 荧光强度为纵坐标，激发光波长为横坐标所得的光谱曲 线为激发光谱。 它反映了在某一固定的发射波长下，不同激发波长激发 的荧光的相对效率。激发光谱可以用于荧光物质的鉴别，并 作为进行荧光测定时供选择恰当的激发波长。 2、荧光光谱 荧光强度为纵坐标，荧光波长为横坐标所得的光谱曲线 为荧光光谱。 它反映了在相同的激发条件下，不同波长处分子的相对 发射强度。荧光（发射）光谱可以用于荧光物质的鉴别，并 作为荧光测定时选择恰当的荧光测定波长或滤光片。
五、荧光分析法的定性和定量
一 定性 荧光分析法定性时，一定要有标准品作对照。 荧光物质的最大激发波长和所发射的最强荧光波 长是鉴定物质的根据，也是定量测定时的最灵敏
的条件。
二 定量 若被测物本身发生荧光，则可以通过直接测量其 荧光强度来测定该物质的浓度。 大多数的无机化合物和有机化合物，它们或不发 生荧光，或荧光效率很低而不能直接测定，可采用间 接测定的方法。 无机化合物：例如对氟、硫及铍、镓、硒等稀土 元素的测定。 有机化合物：芳香族化合物、胺类、甾族化合物、 蛋白质、酶与辅酶、维生素及多种药物等的测定。

度，对物质进行定性和定量分析的方法。
第二节 基本原理 一、分子荧光的发生
定义 某些物质分子吸收了一定波长的光能之后， 基态电子跃迁到激发态，很快以无辐射跃迁的 形式下降到第一电子激发态的最低振动能级。 再由第一电子激发态的最低振动能级下降到基 态的各个振动能级，同时发射出比原来所吸收 的频率较低波长较长的光能，这种光称为荧光。
一 光源 测量荧光强度所用的激发光源一般要比测量吸光 度中所用的光源强度强。 二 单色器 1、激发单色器 其作用是获得单色性较好的激发光以激发样品产生 荧光，即选择激发波长。 2、发射单色器 其作用在于把由激发光所发生的反射光、溶剂的散 射光以及溶液中杂质产生的荧光滤去，只让样品溶液 所发生的荧光通过而照射于检测器上。
分子荧光分析法
第一节 概述 第二节 基本原理 第三节 影响荧光测定的因素
第一节 概述
吸收辐射能后处于电子激发态的分子以发射辐射 的方式释放能量回到基态，这一现象称为发光 （光致发光 photoluminescence）。


最常见的两种发光现象是分子荧光（molecular
fluorescence）和分子磷光（ molecular
phosphorescence）。

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根据激发光的波长不同，即物质接受的电磁辐射能量大小不 同，所发射的荧光就不同，分析方法也不同，可分为X射线
荧光分析法、紫外-可见荧光分析法和红外荧光分析法等。

根据发荧光的粒子不同，又可分为分子荧光分析法和原子荧 光分析法。 本章介绍分子的紫外-可见荧光分析法。 荧光分析法（fluorescence analysis）就是利用荧光特性和强
三、荧光强度与溶液浓度的关系
能够发射荧光的物质都应同时具备两个条件：一是物 质分子必须有强的紫外-可见吸收；二是物质具有较高的 荧光效率（fluorescence efficiency）。 1、荧光物质对光辐射的吸收，服从于朗伯—比尔定律， 即 I / I0 = 10 -abc 荧光物质吸收的光强度 = I0 －I = I0 1 － 10 -abc 2、荧光效率：激发态分子中发射荧光的量子数占吸收 激发光的量子总数的比例，数值在0-1之间。 = 发出的光量子数 / 吸收的光量子数
四、荧光强度的测定
用于测量荧光强度的仪器种类很多，有简单的 滤光片荧光光度计和结构复杂的精密荧光分光光度 计之分。 仪器的部件包括下列四个基本部分 ① 激发光 源 ② 样品池 ③ 检测器 ④ 滤光片或单色器。 由光源发出的光经激发单色器分光后得到特定 波长的激发光，然后入射到样品使荧光物质激发产 生荧光，通常在90度方向上进行荧光测量。经发射 单色器分光后使荧光到达检测器而被检测。
3、镜象关系 两种光谱成镜象对称，是由于大多吸收光谱的形状表 明了分子的第一激发态的振动能级结构，而荧光发射光谱 则表明了分子基态的振动能级结构。能量在基态的振动能 级上分布情况和在第一电子激发态的振动能级上分布相似， 这样就出现了荧光光谱的形状和激发光谱的形状非但极为 相似，而且两者形成镜象。 荧光光谱一般比吸收光谱更简单，缺少了一些短波长 的吸收峰。而且与分子是否被激发至更高激发态无关，即 荧光光谱的形状与激发波长无关。