亲和层析ppt课件

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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
亲和层析的基本特点
1、纯化过程简单、迅速，且分离效率高 2、特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大
分子 3、纯化倍数大，产物纯度高 4、必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的
层析条件 5、价格相对较昂贵； 6、在洗脱中，交联在层析介质上的配基可能脱落并进入
产品中，从而造成不良影响，如抗体、染料等配基。
第七章 亲和层析法
第一节 基本原理
生物亲和作用：生物物质具有识别特定物质并与该物质 的分子相结合的能力。这种识别并结合的能力具有排他性 （能区分结构和性质非常相近的其它分子）。
亲和层析(Affinity Chromatography，AC)是利用生物大 分子具有对一类生物大分子特异识别和可逆结合的特性而 建立起来的一种分离的色谱方法，也叫做生物亲和或生物 特异性亲和色谱。
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通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一类的蛋 白质等生物大分子结合的配体，如各种凝集素（lectine） 可以结合各种糖蛋白，核酸可以结合RNA、结合RNA的蛋 白质等。通用性配体对生物大分子的专一性虽然不如特异性 配体，但通过选择合适的洗脱条件也可以得到很高的分辨率。 而且这些配体还具有结构稳定、偶联率高、吸附容量高、易 于洗脱、价格便宜等优点，所以在实验中得到了广泛的应用。
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亲和吸附介质的配基
（1）酶的抑制剂
一些物质，它们并不引起酶蛋白变性，但能使酶分 子上的某些必需基团（主要是指酶活性中心上的一些基 团）发生变化，因而引起酶活力下降，甚至丧失，致使 酶反应速度降低，能引起这类抑制作用的物质称为酶的 抑制剂（inhibitor）。
在生物体内蛋白酶的抑制剂可与蛋白酶的活性部位
20世纪50年代有意识的利用。 1967年亲和纯化技术从理论走向实用(BrCN活化法修 饰糖类载体用以偶联伯胺类化合物)。 80年代以后，生物亲和作用和其它分离技术的结合。 亲和层析已经广泛应用于生物分子的分离和纯化，如结 合蛋白、酶、抑制剂、抗原、抗体、激素、激素受体、糖 蛋白、核酸及多酶类等；也可以用于分离细胞、细胞器、 病毒等。
3、抑制氢键形成的物质：脲和盐酸胍的存在可减弱亲和作用
4、温度：提高温度，静电作用、氢键、配位键减弱；但是， 疏水性相互作用增强
5、液体离子：SCN-、I-、CIO4-的存在，疏水性相互作用减 弱
6、螯合剂：影响配位键，使亲和作用消失
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1910年最早利用亲和纯化原理分离蛋白质(不溶性淀 粉吸附淀粉酶)。
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2) 配体与待分离的物质之间的亲和力要有较强的 特异性，也就是说配体与待分离物质有适当的亲和 力，而与样品中其它组分没有明显的亲和力，对其 它组分没有非特异性吸附作用。这是保证亲和层析 具有高分辨率的重要因素。
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3) 配体要能够与基质稳定的共价结合，在实 验过程中不易脱落，并且配体与基质偶联后， 对其结构没有明显改变，尤其是偶联过程不 涉及配体中与待分离物质有亲和力的部分， 对二者的结合没有明显影响。
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第二节 操作
一、基质的选择
理想的基质应符合下面的要求：
1．极低的非特异性吸附。
2．高度的亲水性。
3．较好的理化稳定性。
4．大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配体结
合。
5．适当的多孔性。
一般亲和吸附剂采用的基质有纤维素、聚丙烯酰胺
凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖、多孔玻璃珠
等。
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sepharose 4B 具有层析速度较快，化 学稳定性好，非特异吸附少，微球孔径适度， 蛋白载量大的特点，并且有大量可供活化的 羟基，是亲合层析的理想介质。
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二、配体的选择
理想的配体应具有以下一些性质：
1) 配体与待分离的物质有适当的亲和力。亲和力太弱，待分 离物质不易与配体结合，造成亲和层析吸附效率很低。而且 吸附洗脱过程中易受非特异性吸附的影响，引起分辨率下降。 但如果亲和力太强，待分离物质很难与配体分离，这又会造 成洗脱的困难。总之，配体和待分离物质的亲和力过弱或过 强都不利于亲和层析的分离。应根据实验要求尽量选择与待 分离物质具有适当的亲和力的配体。
结合，抑制酶的活性，必要时保护生物组织不受蛋白酶
的损害。酶的抑制剂在分子大小和形态上分布较广，有
天然的生物大分子，也有小分子化合物。
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例如胰蛋白酶的天然蛋白质类抑制剂有胰脏蛋白酶 抑制剂（pancreatic trypsin inhibitor，PTI），卵粘蛋白 （ovomucoid）和大豆胰蛋白酶抑制剂（soybean trypsin inhibitor，STI）等，小分子抑制剂有苄脒 （benzamidine）、精氨酸和赖氨酸。这些抑制剂均可作 为亲和纯化胰蛋白酶的配基，但与酶的结合常数各不相同。 例如，STI与胰蛋白酶的结合常数达109L/mol以上，而对 氨基苄脒（p-aminobenzamidine）与胰蛋白酶的结合数约 为4×104L/mol（25℃）。
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亲和层析原理
★亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连 作为固定相吸附剂
★当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有 和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结 合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出 ★然后改变流动组成份，将结合的亲和物洗脱下来
亲和吸附介质：基质+配体
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4) 配体自身应具有较好的稳定性，在实验中能够耐 受偶联以及洗脱时可能的的较剧烈的条件，可以多 次重复使用。
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根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为 两类：特异性配体（specific ligand）和通用性配体 （general ligand）。
特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生物 大分子结合的配体。如生物素和亲和素、抗原和抗体、酶和 它的抑制剂、激素－受体等，它们结合都具有很高的特异性， 用这些物质作为配体都属于特异性配体。配体的特异性是保 证亲和层析高分辨率的重要因素，但寻找特异性配体一般是 比较困难的，尤其对于一些性质不很了解的生物大分子，要 找到合适的特异性配体通常需要大量的实验。
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亲和作用的机理
1、结构特点（必要条件）：存在凹陷和凸起结构（钥匙 和锁孔的关系）
2、相互作用力的存在
静电作用
氢键
疏水性相互作用
配位键
弱共价键
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影响亲和作用的因素
1、离子强度：一般来说，提高离子强度，亲和作用减弱或完 成破坏。
2、PH：在适当的PH下，亲和结合作用较高，在其它PH下， 亲和作用减弱或完成破坏。