植物病原菌分离方法

植物病原细菌分离常用的消 毒方法
➢漂白粉溶液处理3～5min，然 后用无菌水冲洗
➢次氯酸钠溶液处理2min，然后
用无菌水冲洗。
分离培养基
➢肉汁胨培养基（NA） ➢马铃薯葡萄糖（或蔗糖）培养
基pH调节至6.5，
稀释分离法 制备细菌悬浮液
➢ 取灭菌培养皿加无菌水适量，切取 约4mm见方的小块病组织，经过表 面消毒和无菌水冲洗3次后，移在 无菌的研钵中将病组织研碎，静置 10～15min ，使组织中的细菌进 入水中置成悬浮液。
➢ 观察和记载的项目主要是：
菌落的质地； 菌落形成是凸起的或者有成簇的菌丝
体； 形成成堆的孢子是干的或粘性的； 各种子实体和休眠结构（厚垣孢子、
菌核等）的形成和所需的时间； 菌落正面和背面的颜色，有无色素参
入培养基中； 有无特殊气味； 菌落中有没有部分呈扇状； 生长率的快慢，如菌落长到一定直径
细菌。 腐烂型的细菌病害即是混合
侵染的，但也有一种是主要 的。 各种植物病原细菌生长快慢 不同
➢假 单 胞 菌 属 和 欧 文 氏 菌 属 细 菌：1~2天
➢土壤杆菌属细菌：2~3天 ➢黄单胞菌属细菌：3~4天 ➢棒杆菌属的细菌：5-8d才出现
明显的菌落。
琼胶平板上菌落的观察主要 是：
➢形状和大小、颜色和光泽、表
温度 pH
如立枯丝核菌的分离方法
➢ 诱饵法 ➢ 离心法
➢ 快速生长法
五、影响病原菌分离失
败的原因
从以下几个方面寻找原因
➢材料：新鲜？病菌活否。杂菌 滋生状况
➢ 消毒剂及处理方法适宜否 ➢培养基是否适宜，包括理化性
状 ➢ 培养条件符合 ➢菌的生物学特性，其对腐生条
件的适应能力
六、 病原菌的纯化技
70％酒精表面消毒→切去表 面→接种 根腐病菌病原真菌分离：
由材料大小决定：大→②；小 →①
肉质组织中病原真菌分离：采 用②
种子内病原真菌分离：
整粒种子表面消毒，水洗后→ 接种到平板
种子如在未裂开果荚中可不消 毒接种到平板
孢子分离法
配成孢子悬浮液以稀释法或划 线分离法
✓ 青霉（Pencillium）
第四章 植物病原菌分
离与纯化
植物病原菌
一、植物病原菌分离流
程
二、分离的准备
分离的准备工作
➢ 无菌室操作前保持清洁无菌 ➢ 接种工作准备 ➢ 培养基的准备
分离材料选择
➢ 以收获的材料从病健交界处采样 ➢ 果实腐烂从开始腐烂处分离 ➢ 根腐和枯萎层可能从离土较远处
分离 ➢ 有些枯萎如野火病被固定在局部，
✓ 含氮量的测定方法有很多，常用凯氏定 氮法。
显微操作仪分离法
七、真菌的培养性状
植物病害方面，培养真菌的目 的主要是观察它的性状和研 究环境条件对它的影响，或者 是大量繁殖后用于接种或其 他试验。
培养的方法是将纯化的菌种， 根据试验的要求，移植在适当 的固体或液体培养基上培养， 后者可以静止或振荡培养。
➢ 固体培养 ➢ 液体培养
静→动
培养性状的观察
八、植物病原菌的生长
量测定
植物病原微生物特别是单细 胞微生物，体积很小，个体生 长很难测定，意义也不大。
通常测定微生物的生长是测 群体的生长，测定繁殖则都要 建立在计数基础上。
植物病原细菌生长量测定法 直接法
➢ 测体积
粗放的方法，将待测培养液放在刻度 离心管中作自然沉降或进行一定时间 的离心，然后观察沉降物的体积。
板，但难于掌握温度，也可平 板涂布。
组织分离法（真菌）
➢ 切取小块病健交界处的病组 织，经表面消毒和灭菌水洗过 以后，移在琼胶培养基平板上 培养，待真菌长出后挑取菌丝 进行纯化，得到植物病原真菌 的分离方法。
➢ 囊菌和半知菌等大多数真菌 用常规组织分离法分离
组织分离法步骤
环境的清洁和消毒
分离用具的消毒 分离材料的选择 培养基平板制备 病组织用水冲洗 分离材料表面消毒 分离材料接种
所需的时间。菌落的颜色也要不断地 观察，它的颜色是随着时间而改变的。
➢ 培养性状的描述，要注明培养基的 种类、培养温度和有无光照等。
真菌培养性状的观察，最好多用几种 培养基。
✓ 如 镰 刀 霉 属 (Fusarium ) 和 青 霉 属 （Penicillium）等，在各种培养基上 的培养性状在鉴定上是很重要的。
将剪成2-3毫米大小组织用灭菌镊子 夹取放入培养基平板上，轻轻按压。 每皿4-5块，排放均匀。
贴标签和培养
将培养皿翻转放置于23-25℃培养3-4 日
纯化
挑选由分离材料上长出的典型而无杂 菌的菌落，在菌落边缘用移菌针挑取 带有菌丝的培养基一小块，转入试管 斜面培养基中央，于25℃温箱中培养。
➢ 真菌有菌丝可穿透培养基，而细菌 无这种能力，先将真菌接种倒平板 上，然后再加一层Agar，菌丝透过 而在表面生长
➢ 加玻片，加玻棒，利用气生菌丝甩 掉细菌。
病原真菌的分离举例
斑点病病原真菌分离：取5×5 mm2组织→70％消毒几秒→ 无菌水洗3次→升汞消毒3－
5min→无菌水洗3次→接种 维管束内病原真菌分离：
现几种不同形状的菌落，终有 1种是主要的。 如果菌落类型很多，且不分主 次，很可能未分离到病原细 菌，应考虑重新分离。 如果不熟悉1种细菌菌落的性 状，就应选择几种不同类型的 菌落，分别培养以后接种测定 其致病性，最终确定病原细 菌。
一种细菌病害一般是由一种 病原细菌引起的，琼胶平板上 出现几种不同类型的菌落，实 质上只有一种是真正的病原
➢ 将熔化的琼脂培养基冷却到45℃ 左右，分别倒入培养皿中， 摇匀 后静置冷却，凝固后在培养皿盖上 标明分离材料、 日期和稀释编号 等。
挑取单菌落，转入斜面培养基。
平板划线分离法
➢ 制备细菌悬浮液 ➢ 划线（动画）
用灭菌移植环蘸取以上悬浮液 在表面已干的琼脂平板上画 线，先在平板的一侧顺序画3～ 5条线，再将培养皿转60º，将
好的消毒液易使有色纸褪色，且产生氯 气有强烈臭味。
一般3－5min，时间长短因材料不同而 不同。处理种子5－10min，长的可达20 －30min。
➢ 优点：杀菌能力强，具有挥发性，不 会遗留在组织上影响分离结果，其杀 菌能力小于升汞。
➢ （3）酒精：70％，浸很短时间
（几秒到1min）灭菌水洗。
细菌的排除
➢ 将培养基调节至酸性环境，10ml培 养基中加3滴25％的乳酸
➢ 加孟加拉红，配培养基时加入 35mg/L
➢ 加抗生素，除氯霉素外，其余均灭 菌后加入
金霉素：抑制多数细菌（30ug/ml） 青霉素：抑制G+细菌，20ug/ml 多粒霉素B：抑制G-细菌（5ug/ml） 链霉素：40ug/ml 氯霉素：50ug/ml，大部分细菌
移植环经火焰灼烧灭菌后，从 第2条线末端用相同方法再画 3～5条线。也有其他画线形式， 如四分画线和放射状画线等， 其目的都是使细菌分开形成分 散的菌落。
➢ 贴标签
分离材料和日期等
➢ 培养及结果观察
挑取单个菌落接种于斜面培 养基上，如果不纯，再移植纯 化，最后得到纯培养。
若分离成功，琼胶平板上菌落 形状和大小比较一致，即使出
✓ 丝状真菌用滤纸过滤，细菌可用醋酸 纤维膜等滤膜过滤。
✓ 过滤后，细胞可用少量水洗涤，再真 空干燥（40℃以下），称干重。
间接法 生理指标法
➢ 与生长量相平行的生理指标很多， 它们均可用作生长测定的相对值。
测细胞总含氮量
✓ 大多数细菌的含氮量为干重的12.5%， 酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%
✓ 链孢菌属（Alternaria） ✓ 小丛壳属（Glomerelia） ✓ 茎点菌属（Phoma） ✓ 拟茎点菌属（Phomopsis） ✓ 曲霉
特殊类型真菌的分离 采用特殊的方法分离
特殊的培养基；如
集孢粘菌：（Acraciomycetes） 以E.coli为食
专性寄主的用诱饵分离
采用特殊的培养条件
➢ 称干重
采用离心法或过滤法测定，一般干重 为湿重的10%~20%。
离心法（细菌）
✓ 将待测培养液离心，再用清水洗涤离 心1~5次后干燥，可用105℃、100℃ 或红外线烘干，或在较低的温度（80℃ 或40℃）下进行真空干燥，然后称干 重。 如细菌一个细胞一般重 10-12~10-13g。
过滤法
较 大 的 材 料 在 酒 精 中 浸 或 棉 花 擦，然后在火焰烧去。
幼嫩的病组织，表面用药剂消毒 时可能会同时杀死其中的病原真 菌，消毒时间应尽量缩短。比较 安全的方法是不用药剂消毒，而 以灭菌水换洗八九次。
培养基的准备 分离失败的原因，有时是由于培
养基不适宜。
➢ 寄生性细菌对培养基的要求要比腐 生性细菌严格。
面是否隆起或凹陷、边缘的形 状、透明度和粘度、培养基颜 色的变化等。
在固体培养基上的菌落形态
➢植物病原细菌菌苔形状的差异 一般是比较小的。菌苔的表面 有光滑的、不平整的和有皱褶 的、易挑取、质地均匀 。
➢菌苔的颜色也不同，质地有粘 质的、膜质的或蜡质的。菌苔 有透明的、半透明或不透明的， 表面有暗色的或发亮的。
术
研究植物病原菌的遗传、变异 性征，同异亲配合，都要求菌 种单孢
不同的病原菌纯化方法好坏 依人而异。
平板稀释纯化法
➢ 混菌法
灭菌水冲洗→大致稀释（每皿30个菌 左右）→取一定量菌液悬浮液与熔化 后45℃培养基混匀→合适温度培养→ 形成菌落→移植
➢ 平板涂布法
取菌液0.1ml→涤布→静5min或无菌 风吹干→倒置培养
➢ 应用范围
细菌、酵母、产孢多真菌纯化
➢ 优点：操作简便 ➢ 缺点：不能看到和不能一个菌落是
从单孢繁殖而来，纯化可靠性差。
应用范围：细菌、酵母、
产孢多真菌等细胞较大