第5章细胞融合

2.组织的消化 通过生物化学的方法将剪碎的组织块分散成 细胞团或单细胞。可根据不同的组织对象采用不 同的酶消化液，如最常用的有胰蛋白酶和胶原酶 等。其他的酶如链霉蛋白酶、黏蛋白酶、蜗牛酶 等也可用于动物组织的消化。EDTA最适合消化 传代细胞，常与胰蛋白酶使用。 下面分别以胰蛋白酶和胶原酶为例介绍一下 动物组织的消化方法：
（二）动物单个细胞的获得 动物细胞虽然没有细胞壁，但细胞间的连接 方式多样而复杂，在进行有效的细胞融合之前， 也必须获得单个分散的细胞。主要步骤如下： 1. 组织的获得 采用各种适宜的方法处死动物，取出组织块 放入小烧杯中，用剪刀将组织块剪碎成lmm3大 小，用吸管吸取Hanks溶液冲下剪刀上的碎块， 补加3-5ml的Hanks溶液，用吸管轻轻吹打，低 速离心，弃去上清液，留下组织块。
三 基本原理 对于植物细胞而言， 1、一般先将两种不同植物的体细胞(来自其叶或 根)经过纤维素酶、果胶酶消化，除去其细胞壁， 得到原生质体； ２、 而后通过物理或化学方法诱导其细胞融合形成杂 种细胞； ３、 继而再以适当的技术进行杂种细胞的分检和培养， 促使 杂种细胞分裂形成细胞团、愈伤组织、直 至形成杂种植株，从而实现基因在远缘物种间的 转移。 ４、由 于这个新细胞得到了来自两个细胞的染色体组和 细胞质，在适宜的条件下来培养，长成的生物个 体就是一个新的物种或品系。
(2)微电极型的两个电极的端部同时与两个靠近 的原生质体膜表面接触，微电极所产生的 5~12mA的脉冲电流间断刺激1~5ms，原生质体 在累计几秒到几十秒钟的时间内会发生暂时性的 收缩，两层膜之间形成小孔，连接成桥，形成一 个个泡囊，经点连接到面连接，最后形成融合体， 整个过程大约10~30min。 (3)平行多电极通过1兆赫(MHz)交流电场发生双 向电脉冲，原生质体在电场力的作用下，极化产 生偶极子，原生质体紧密排开成串珠状(图5-5中 C)。在适当时间和强度(如50mA l.2~2kV／cm)的 直流电脉冲作用下，质膜被击穿，进一步形成融 合体。应用如下图所示。
（一）生物法——仙台病毒法 我们知道很多病毒都具有凝集细胞的能力，它一边黏 接在一个细胞表面，另外一边黏接在另一个细胞表面， 从而使两个细胞在病毒的作用下靠近发生凝结。 在动物细胞融合中，仙台病毒(HVJ)已成为产生细胞 杂种的标准融合剂。 病毒促使细胞融合的主要步骤如下： (1)两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近。 (2)通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜 间互相渗透，胞质互相渗透。 (3)两个原生质体的细胞核互相融合，融为一体。 (4)进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体 的杂种子细胞。 过程图解如下图所示。
(4)细胞融合过程中，通常耗氧量较大，缺氧时经 常不融合。空气中含氧量大于20％时有一定融合 率，但有些细胞在无氧条件下也可融合。 (5)有些细胞融合时需要Ca2+ ，否则不融合，细 胞蛋白质亦发生变化。实验表明Sr2+、Ba2+ 、 Mg2+ 、Mn2+ 等离子可代替Ca2+，但有效浓度较 Ca2+大的多。融合时最适合的离子强度一般为 0.1mol／L。 (6)最适合的pH为7.4~7.8之间，在此范围之外， 融合率均较低。
第五章 细胞融合
一 细胞融合的定义 细胞融合是20世纪60年代发展起来的一项细 胞工程技术。细胞融合(Cellfusion)又称体细胞杂 交(Somatic hybridization)，是指将不同来源的原 生质体(除去细胞壁的细胞)相融合并使之分化再 生、形成新物种或新品种的技术。
二.细胞融合的意义 1.通过原生质体融合进行体细胞杂交已成为细 胞工程研究的重要内容之一。可把这种技术 应用于遗传性状改良、克服远缘杂交中的不 亲和障碍、更加广泛地组合起各种植物的优 良遗传性状，从而培育出理想的新品种。 2.进行体细胞融合可以避开生殖细胞的受精过 程，从而在亲缘更远的物种间实现基因转移， 创造出自然界中所没有的新物种。
胶原酶：是一种由细菌中提取的酶，对胶原和细胞间质 有较强的消化作用，适用于消化纤维组织、上皮组织、 癌组织等。胶原酶不受Ca 2+、Mg2+的螯合影响，可 用BSS和含血清培养基配制成200U／ml或0.1~0.3mg／ ml浓度，作用温和，无需机械振荡。具体消化方法如下： (1)向培养瓶中放入1~5mm3大小的组织块，加 5m12000U／ml的胶原酶母液，最终浓度为200U／ml， pH=6.5 。 (2)36.5 ℃水浴4~48h，无需摇动，中间可更换酶液一次。 (3)当组织变软，分散于瓶底时，轻轻振荡即散成细胞 团或单个细胞，小心倒出培养液。 (4)800r／min离心5min，弃上清液，重新悬浮BSS溶液 中，再离心一次。 (5)加入培养液制成细胞悬浮液。
2. 基本过程 以植物原生质体为例，PEG法诱导原生质 体融合的过程见图5-4所示。 融合中应注意： (1)事先要做好两种原生质体的识别标记，如 色素、缺陷型、抗性标记等。 (2)原生质体的密度应在105个／ml左右，两种 原生质体按1:1等量混合。
(3)常用PEG的分子量通常为4000~6000，加热熔 化与Eagle溶液配成50％(W／V)浓度(小分子质 量的PEG配成55％浓度)。加入PEG后，24 ℃ 培育10-20min(注意时间宜短不宜长，过长，使 原生质体周围包裹一层膜形成凝集体，会降低 融合率)，缓缓加入高pH、高钙离子溶液， 15min后用冲洗液清洗，离心收集原生质体。 (4)计算：融合率=(融合细胞的细胞核总数／视野 内全部细胞的细胞核总数)×100％
1 .基本原理 聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)是一 种多聚化合物，分子式为H(OHCH2— CH2)nOH，商品名卡波蜡(Carbowax)。实验 室用的PEG平均相对分子质量在200- 20000之 间，一般1000以下者为液体，1 000以上者为 固体。1974年人们用它诱导大麦、大豆等植 物原生质体融合，以后又用PEG诱导与用高 Ca2+和pH诱导相结合，极大地提高了融合效 率。
胰蛋白酶：尤其适合于细胞间质较少的软组织， 如胚胎、羊膜、上皮、肝、肾以及传代细胞等。 用胰蛋白酶消化动物细胞的基本步骤如下： (1)向剪碎的组织块中加入30-50倍体积的0.25％ 浓度的胰蛋白酶。 (2)在37℃水浴内消化30~60min，每5-l0min摇动 一次，根据具体情况可以中间更换消化液。 (3)Hanks液漂洗两次，每次2~3min 。 (4)800r／min离心5min，弃上清液，加入营养液。 如果有大块，可用纱网过滤。
下图所示的是两个不同的原生质体或细胞融合成 一个新的融合细胞的原理示意图：将不同来源的 两个原生质体或细胞通过细胞融合，得到含有两 者遗传信息的新的杂合细胞，然后通过培养基筛 选出这种杂合细胞，就有可能得到一个新生物。
植物细胞融合过程示意图:
显微镜下的细胞融合过程见图5-2
细胞融合主要经过了两原生质体或细胞互 相靠近、细胞桥形成、胞质渗透、细胞核融 合几个步骤来自百度文库其中细胞桥的形成是细胞融合 最关键的一步，融合过程中两个细胞膜从彼 此接触到破裂形成细胞桥的具体变化过程图 解如图5-3所示。 细胞融合现象最初是在动物细胞中发现的。 后来，细胞融合技术逐步扩展到植物细胞 和微生物细胞。
3.体细胞融合还有一个重要的价值，就是创造 细胞质杂种。在体细胞杂交中双亲的细胞质 都有一定的贡献。据试验，融合后的杂种细 胞质最终会选择某一亲本的叶绿体，但线粒 体可以实现双亲重组。因此，有可能通过细 胞融合获得细胞核、叶绿体、线粒体基因组 的不同组合，这在育种上无疑有着重大价值。 4.体细胞杂交在作物育种和种质创新上有其独 到的意义和作用。随着新的融合技术(如电融 合技术)进一步完善和发展，体细胞杂交对作 物改良必将发挥出更大的作用。
五 细胞融合技术 为了使制备好的原生质体或细胞能融合在一 起，选择适宜有效的诱导融合方法很重要。诱导 融合的方法可分为物理法、化学法及生物法。物 理法主要包括显微操作、电场刺激等；化学法主 要是用聚乙二醇PEG结合高pH、高钙离子法； 生物法有仙台病毒法等。具体应用时要根据不同 对象选择不同的细胞融合方法和条件。诱导动物 细胞融合，仙台病毒HVJ诱导、PEG法、电融合 法都适用；植物细胞融合常用PEG法和电融合法； 微生物细胞融合只适用PEG法。表5-1显示不同 细胞融合的条件及其主要应用。
(四) 细胞融合的影响因素 1. 植物细胞融合 植物原生质体融合无种属特异性，故其融合效率仅 与外界条件有关，而与其自身种属无关。如何确定不同 材料的融合条件，需经过具体实验制定出最佳融合方案。 植物细胞融合的影响因素如下： (1)PEG诱导融合的关键是作用时间，尤其是高Ca 2+和 pH溶液处理时间长短非常重要。时间过长原生质体损 伤严重，融合效率降低；过短则不融合。 (2)PEG规格和纯度与融合效率亦有关系。以往认为PEG 分子质量越大，对细胞毒性越大，因此选用分子质量小 的PEG。但是目前发现PEG毒性是其中杂质所致，经纯 化后即无毒性。故目前应用分子质量较大者(4000~6000) 居多。因此操作时应注意PEG纯度。
（二）化学法——PEG结合高Ca2+、pH诱导法 细胞融合中的化学法诱导主要包括：NaNO3 诱导(NaNO3可中和原生质体表面负电荷，促进 原生质体聚集，对原生质体无损害，但融合效率 低)、高Ca2+和pH诱导法、PEG诱导、高Ca2+和 pH诱导PEG结合诱导等。上面几种方法中以后 者最为常用，下面做一重点介绍：
(三)物理法——电融合诱导法 1 基本原理 电融合法是20世纪80年代出现的细胞融合技 术。在直流电脉冲的诱导下，原生质体质膜表面 的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质 体黏合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接， 直到闭和成完整的膜形成融合体。与PEG法比较， 电融合法优点较多，如融合率高、重复性强、对 原生质体伤害小；装置精巧、方便简单、可在显 微镜下观察或录像融合过程；免去PEG诱导后的 洗涤过程、诱导过程可控制性强等等。电融合设 备及原理如图5-5：
2 基本过程 电融合装置的电极有两种：微电极型(图5—5 中B)和平行多电极型(图5-5中A)，它们的特点与 操作如下： (1)将制备好的亲本原生质体均匀混合放入融合 小室中，微电极型只有一个小室(图5-5中B)，平 行电极型有4个小室(图5-5中A)，两电极间隔 3mm，整个装置放在一个培养皿中。
四 融合材料 （一）植物或微生物原生质体的制备 植物和许多微生物细胞外有一层坚韧的细胞 壁，如植物细胞质膜外面包裹一层细胞壁，各 细胞壁间有果胶层将细胞联结在一起。为了促 使这样细胞的融合就必须先得到单个细胞，除 去细胞壁，才能获得植物原生质体或微生物原 生质球。因此对于植物和微生物细胞的融合一 般又可称为原生质体融合。
(3)在电场诱导融合时，融合率与原生质体密度 有关；密度小于104个／ml融合效率低；大于105 个／ ml会融合成团，难以达到预期效果。最适 宜的密度一般为2×104~8 × 104个／ ml 。 (4)在融合液中加入少量CaCl2，既可维持一定电 导率，对细胞也有保护作用；其次交变电流强弱、 处理时间长短及电脉冲大小均会影响融合率。 (5)此外，用混合盐溶液对原生质体进行融合前 预处理，以及在促融剂中添加伴刀豆球蛋白、二 甲基亚砜、胰蛋白酶、精胺或亚精胺等亦可提高 融合效率。
2.动物细胞融合 在动物细胞融合过程中，除促融剂外，其他如细胞 性质、温度、pH、离子强度及离子种类等均会影响细 胞融合效率。 (1)首先，亲本细胞表面性质影响较大，表面覆盖绒毛 而不规则者较易融合，而表面光滑者较难融合。 (2)细胞种类不同，融合效果也不同，如腹水癌及株化 细胞较易融合，而淋巴细胞或血球细胞几乎不融合。 (3)细胞融合时需要适宜温度和运动状态。如仙台病毒 诱导欧利希氏腹水癌细胞融合时，于37 ℃振摇时易于 融合，且融合效率与病毒量呈正比。但在34 ℃振摇则 融合率下降。在37℃时不振摇则几乎不融合。