十三种神经递质和神经肽在参环毛蚓神经系统的分布_免疫细胞化学研究_罗振国
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2结果
在参环毛蚓脑, AVP 阳性神经细胞 ( 图版 Ñ : 1) 、ACT H 阳性神经细胞 ( 图版 Ñ : 2) 、CCK 阳 性神经细胞 ( 图版 Ñ : 3) 、降钙素阳 性神经细 胞 ( 图版 Ñ : 4a) 、 谷氨 酸阳 性神 经 细胞 ( 图版 Ñ : 5) 、NP Y 阳 性神 经细胞, 染 色浓重, 分 布密集, 位于脑的后侧半 ( 图版 Ñ : 6) , 尤其特别的是在降 钙素阳性大神经细胞内含有粗 大密集的分泌 颗粒 ( 图版 Ñ : 4b) 。B- EP 阳性神 经细胞染色较淡 ( 图 版 Ñ : 5) , OT 阳性神经细胞染色也较深, 但分布 稀疏 ( 图 版 Ñ : 7) , calbindin- D、 GABA、SOM 、 V IP、呈阴性反应; 在咽下神经节与腹神经节, 仅 有少量 AVP 阳 性神经细 胞 ( 图版 Ñ : 8) 、glut amate 阳性神经细胞 ( 图版 Ò : 9) 和 NPY 阳性神 经细胞 散在分布 ( 图版 Ò : 10) ; 在肠神经系统, B-EP 阳性神经细胞 ( 图版 Ò : 12) 、CGRP 阳性神
乏生活在中国的特有动物的研究资料, 本文就以上 神经递质和神经肽是否存在于中国参环毛蚓, 是否 还有新的神经递质和神经肽存在, 进行了研究, 以 期为低等动物神经科学的研究提供基础研究资料。
1 材料和方法
111 动物饲养及处理 取健康成体参 环毛蚓 40 条, 避光潮湿 饲养。
饲以纸浆、琼脂, 排空泥沙, 酒精麻醉, 取材固定 于含 4% 多聚甲醛的 0101 mol/ L 磷酸缓冲液 ( pH 712) 6 h, 后入含 30% 蔗糖 0101 mol/ L 磷酸缓冲 液 ( pH 714) 脱水 至下沉。标本经 OCT ( 美国) 包埋, 液氮冷冻, 依头尾方向经 L eica- 1100 恒冷切 片机冷冻连续切片 ( - 20bC) , 片厚 20 Lm 。 112 免疫组织化学染色
在高等动物中, 约有 10 多种神经递质和神经 肽既存在于胃肠道又存在于脑 ( 张殿明等, 1991) , 在环节动物参环毛蚓, 此类脑肠双重分布的仅有降 钙素、谷氨酸和血管活性肠肽, 前两者不包括在高 等动物的神经递质和神经肽种类内, 表明脑、肠双 重分布的神经递质和神经肽的进化经历了复杂的过 程, 在低等动物脑肠共存的神经递质和神经肽, 随 着机体结构与功能的改变而消亡, 新的脑肠神经递 质和神经肽应新的结构与功能的要求而不断产生,
5期
罗振国等: 十三种神经递质和神经肽在参环毛蚓神经系统的分布: 免疫细胞化学研究
643
表 1 13 种神经递质和神经肽免疫反 应阳性细胞在参环毛蚓神经系统中的分布 Table 1 Distribution of 13 neurochemically positive cells in the nervous system of the earthworm ( Pheretima aspergillum)
第一作者简介 罗振国, 男, 50 岁, 博士, 教授。研究方向: 神经生物学。
6 42
动物学报
48 卷
体 ( Sigma, USA) 1B3 000、精氨 酸血 管 加压 素 ( AVP) 抗体 ( arg inine vasopressin, Sigm a, USA) 1B3 000、CCK 抗体 ( Sigma, USA) 1B3 000、降 钙素 抗体 ( calcitonin, Sigma, USA) 1B3 000、钙 结合 蛋白 抗 体 ( calbindin D- 28- K, Sigma, USA ) 1B3 000、CGRP 抗体 ( Sig ma, USA) 1B3 000、B内啡肽 ( B- EP ) 抗体 ( Sigm a, USA) 1B3 000、谷 氨酸抗体 ( glut amate, Sig ma, U SA) 1B3 000、C氨基 丁 酸 ( GABA ) 抗 体 ( C- amino butyric acid IgG, Sigm a, USA) 1B3 000、NPY 抗体 ( Sigma, U SA) 1B3 000, 催产 素 ( OT ) 抗 体 ( oxyt ocin, Sigma, USA) 1B3 000、生长 抑 素 ( SOM ) 抗 体 ( som atost at in, Sigma, U SA) 1B3 000和 VIP 抗体 ( Sigma, USA) 1B3 000在 4 e 孵育 12 h, 生物素 化的 猪 抗 兔 IgG ( biot inylat ed sw ine ant-i rabbit IgG, Dako) 1B200 在 37 e 孵育 120 m in, 链霉亲和 素抗生 物 素 - 辣根 过 氧 化物 酶 复 合体 ( st rept avidin/ HRP, Dako ) 1 B200 在 37 e 孵 育 60 min, DAB 显色, 1% 酒精- 苏木素衬染。
免疫细胞化学染色: 切片经 0101 mol/ L 磷酸 缓冲液 ( pH 714) 漂 洗, 3% H2O2 处 理 30 min, 3% 正常猪血清封闭 30 m in, 兔抗 IgG: ACT H 抗
2001-02-19 收稿, 2001-10-30 修回 * 国家自然科学基金项目 ( N o. 39770383) ** 通讯作者 E-mail: l qlzg@ yahoo. com. cn
经细胞 ( 图版 Ò : 11) , SOM 阳性神经细胞 ( 图版 Ò : 14) 和 VIP 阳性神经细胞 ( 图版 Ò : 15) , 染 色较深, 分布散在; 在肠上皮, CGRP 阳性上皮细 胞 ( 图版 Ò : 11) 、calcit onin 上皮 细胞 ( 图版 Ò : 13) 和 VIP 阳性上皮细胞 ( 图版 Ò : 15) 、呈强阳 性反应, 分布于阴性上皮细胞之间。
动物学报 48( 5) : 641~ 647, 2002 A ct a Zoologica Sinica
十三种神经递质和神经肽在参环毛蚓神经系统 的分布: 免疫细胞化学研究*
罗振国 ¹** 赵 越 º 韩庆国 ¹ 张小云 ¹
( ¹ 深圳大学生物工程系, 广东深圳 518060) ( º 广东药学院药学系, 广州 510224)
对照实验: 以正常兔血清和 PBS 代替一抗分别 行替换对照和空白对照, 同步进行上述免疫组织化 学染色, 结果为阴性。 113 形态学测量
用装有目镜 网格的显微镜, 10 @ 10 放大 倍数 下, 分别计数抗体反应切片的脑、咽下wenku.baidu.com经节、腹 神经节和肠的阳性细胞, 每种抗体每个部位观察计 数 50 个视野。
摘 要 选择生活在我国的环节 动物门 典型代 表参环 毛蚓 ( Pher etima asp ergillum) 为研 究对象, 使用 13 种 抗 体, 运用免疫细胞化学染色技术, 在光学显微镜下观察神经递质和神经肽阳性细胞的形态与分布。研究发现在参 环毛蚓脑, ACT H 阳性神经细胞、AV P 阳性 神经细 胞、calcitonin 阳性 神经细 胞、CCK 阳性 神经细 胞、glutamate 阳性 神经细胞和 NP Y 阳性神经细胞染 色浓重, 分布密集, 位于脑的后侧半, 尤其特别的是在 calcitonin 阳性大 神 经细胞内含有粗大密集的分泌颗粒。B- EP 阳性神经细胞染 色较淡, OT 阳性神经 细胞染色 也较深, 但分 布稀疏, calbindin- D 、CGRP 、GA BA、SOM 、V IP 呈阴性反应; 在咽下神 经节与腹神经节, 仅有少量 AV P 阳性 神经细胞、 g lutamate 阳性神经细胞和 N PY 阳性神经细胞散在分布; 在肠神经系统, B- EP 阳性神经细胞、CGRP 阳性神经 细 胞、SOM 阳性神经细胞、VI P 阳性神经细胞染色较 深, 分布散在; 另 外, 在肠上皮, CGRP 阳性上 皮细胞、ca-l citonin 上皮细胞和 V IP 阳性上皮细胞 呈强阳性反应, 分布于 阴性上皮 细胞之 间。结果 表明参环 毛蚓神 经系统 存 在着 在其它环节动物所观察到的神经递质和神经肽: ACT H、VI P、B- endo rphin、CCK、N PY 、CGR P, 亦存在 着 文献 从未报道过的神经递质和神经 肽: calcitonin、AV P、OT 、glutamate、SOM , 其中 calcitonin、CGRP 、V IP 双 重分布于神经细胞和非神经组织的肠上皮细胞, 本文首次提供了形态学的证据。 关键词 参环毛蚓 神经递质 免疫细胞化学
3讨论
311 环节动物神经化学神经细胞的种类、分布特 点
哺乳动物的脑神经细胞是以功能性核团的形式 存在, 某个核团以一种或数种神经化学神经细胞为 主。严格来说, 环节动物并不具备真正的脑, 它所 谓的脑不过是个神经节而已, 它的脑不存在有功能 性核团, 神经化学神经细胞的分布较为弥散, 各种 神经化学神经细胞的分布 没有显著的区 域性。然 而, 环节动物的脑神经节在神经化学神经细胞的种 类、分布方面远较哺乳动物的神经节复杂。这是因 为环节动物的脑神经节某种程度上还起脑的作用, 指挥整体的活动。若将鼠神经节与环节动物的脑神 经节作一比较, 可以看出环节动物的脑神经节含有 种类较丰富的神经化学神经细胞。若就神经化学神 经细胞的形态进行比较, 鼠的下丘脑分泌神经细胞 分为两类, 一类为小细胞分泌神经细胞 ( parvoce-l lular neuroendocrine cells) , 呈锥形或三角形, 体积 较小, 具有典型的鹰眼样核; 另一类为大细胞分泌 神经细胞 ( magnocellular neuroendocrine cells) , 呈 圆形或 卵圆型, 体积 肥大, 核大 而偏位, 核仁清 楚。此类神经细胞主要分布在下丘脑室旁核、视上 核, 其纤维投射到神经垂体, 释放调节性神经递质 和神经肽入血循环。环节动物的某些递质能神经细 胞形态上与大细胞分泌神 经细胞类似, 也呈卵圆 型, 体积较大, 在 calcit onin 阳性大神 经细胞内含 有粗大密集的分泌颗粒。因此这些大神经细胞极可 能还是分泌性神经细胞。
哺乳动物神经系统中存在着约 40~ 50 余种神 经化 学 物 质 如 肽 类 和 氨 基 酸 递 质 ( Adelman, 1987) 。随着进化程度的降低, 无脊椎动物神经系 统存在的这些神经递质和神经肽的种类显著减少, 据目前文献报道, 在环节动物 的神经系统存 在约 10 余种, 它们是血管活性肠肽 ( vasoact ive intest-i nal polypept ide, VIP) ( Sundler et al . , 1977) 、促 肾上 腺 皮 质 激 素 ( adrenocort icotropin hormone, ACT H) 、P 物质 ( subst ance P , SP) ( Aros et al . , 1980) 、脑啡肽 ( enkephalin) 、B- 内啡肽 ( B- endorphin) ( Alumets et al . , 1979) 、促肾上腺皮质激素 释放 因 子 ( cort icotrophin releasing factor, CRF ) ( Remy et al . , 1982 ) 、 胆 囊 收 缩 素 ( cholecyst okinin, CCK) ( Lkhider et al . , 1987) 、神经肽 Y ( neuropept ide Y, NPY) 、降钙素基因相关肽 ( ca-l cit onin gene- related pept ide, CGRP ) 、 5-羟 色 胺 ( seret onin, 5-HT ) ( Csoknya et al . , 1992) 和胃泌 素 ( gast rin, GS) ( Reglodi, et al . , 1999) 。鉴于缺
在参环毛蚓脑, AVP 阳性神经细胞 ( 图版 Ñ : 1) 、ACT H 阳性神经细胞 ( 图版 Ñ : 2) 、CCK 阳 性神经细胞 ( 图版 Ñ : 3) 、降钙素阳 性神经细 胞 ( 图版 Ñ : 4a) 、 谷氨 酸阳 性神 经 细胞 ( 图版 Ñ : 5) 、NP Y 阳 性神 经细胞, 染 色浓重, 分 布密集, 位于脑的后侧半 ( 图版 Ñ : 6) , 尤其特别的是在降 钙素阳性大神经细胞内含有粗 大密集的分泌 颗粒 ( 图版 Ñ : 4b) 。B- EP 阳性神 经细胞染色较淡 ( 图 版 Ñ : 5) , OT 阳性神经细胞染色也较深, 但分布 稀疏 ( 图 版 Ñ : 7) , calbindin- D、 GABA、SOM 、 V IP、呈阴性反应; 在咽下神经节与腹神经节, 仅 有少量 AVP 阳 性神经细 胞 ( 图版 Ñ : 8) 、glut amate 阳性神经细胞 ( 图版 Ò : 9) 和 NPY 阳性神 经细胞 散在分布 ( 图版 Ò : 10) ; 在肠神经系统, B-EP 阳性神经细胞 ( 图版 Ò : 12) 、CGRP 阳性神
乏生活在中国的特有动物的研究资料, 本文就以上 神经递质和神经肽是否存在于中国参环毛蚓, 是否 还有新的神经递质和神经肽存在, 进行了研究, 以 期为低等动物神经科学的研究提供基础研究资料。
1 材料和方法
111 动物饲养及处理 取健康成体参 环毛蚓 40 条, 避光潮湿 饲养。
饲以纸浆、琼脂, 排空泥沙, 酒精麻醉, 取材固定 于含 4% 多聚甲醛的 0101 mol/ L 磷酸缓冲液 ( pH 712) 6 h, 后入含 30% 蔗糖 0101 mol/ L 磷酸缓冲 液 ( pH 714) 脱水 至下沉。标本经 OCT ( 美国) 包埋, 液氮冷冻, 依头尾方向经 L eica- 1100 恒冷切 片机冷冻连续切片 ( - 20bC) , 片厚 20 Lm 。 112 免疫组织化学染色
在高等动物中, 约有 10 多种神经递质和神经 肽既存在于胃肠道又存在于脑 ( 张殿明等, 1991) , 在环节动物参环毛蚓, 此类脑肠双重分布的仅有降 钙素、谷氨酸和血管活性肠肽, 前两者不包括在高 等动物的神经递质和神经肽种类内, 表明脑、肠双 重分布的神经递质和神经肽的进化经历了复杂的过 程, 在低等动物脑肠共存的神经递质和神经肽, 随 着机体结构与功能的改变而消亡, 新的脑肠神经递 质和神经肽应新的结构与功能的要求而不断产生,
5期
罗振国等: 十三种神经递质和神经肽在参环毛蚓神经系统的分布: 免疫细胞化学研究
643
表 1 13 种神经递质和神经肽免疫反 应阳性细胞在参环毛蚓神经系统中的分布 Table 1 Distribution of 13 neurochemically positive cells in the nervous system of the earthworm ( Pheretima aspergillum)
第一作者简介 罗振国, 男, 50 岁, 博士, 教授。研究方向: 神经生物学。
6 42
动物学报
48 卷
体 ( Sigma, USA) 1B3 000、精氨 酸血 管 加压 素 ( AVP) 抗体 ( arg inine vasopressin, Sigm a, USA) 1B3 000、CCK 抗体 ( Sigma, USA) 1B3 000、降 钙素 抗体 ( calcitonin, Sigma, USA) 1B3 000、钙 结合 蛋白 抗 体 ( calbindin D- 28- K, Sigma, USA ) 1B3 000、CGRP 抗体 ( Sig ma, USA) 1B3 000、B内啡肽 ( B- EP ) 抗体 ( Sigm a, USA) 1B3 000、谷 氨酸抗体 ( glut amate, Sig ma, U SA) 1B3 000、C氨基 丁 酸 ( GABA ) 抗 体 ( C- amino butyric acid IgG, Sigm a, USA) 1B3 000、NPY 抗体 ( Sigma, U SA) 1B3 000, 催产 素 ( OT ) 抗 体 ( oxyt ocin, Sigma, USA) 1B3 000、生长 抑 素 ( SOM ) 抗 体 ( som atost at in, Sigma, U SA) 1B3 000和 VIP 抗体 ( Sigma, USA) 1B3 000在 4 e 孵育 12 h, 生物素 化的 猪 抗 兔 IgG ( biot inylat ed sw ine ant-i rabbit IgG, Dako) 1B200 在 37 e 孵育 120 m in, 链霉亲和 素抗生 物 素 - 辣根 过 氧 化物 酶 复 合体 ( st rept avidin/ HRP, Dako ) 1 B200 在 37 e 孵 育 60 min, DAB 显色, 1% 酒精- 苏木素衬染。
免疫细胞化学染色: 切片经 0101 mol/ L 磷酸 缓冲液 ( pH 714) 漂 洗, 3% H2O2 处 理 30 min, 3% 正常猪血清封闭 30 m in, 兔抗 IgG: ACT H 抗
2001-02-19 收稿, 2001-10-30 修回 * 国家自然科学基金项目 ( N o. 39770383) ** 通讯作者 E-mail: l qlzg@ yahoo. com. cn
经细胞 ( 图版 Ò : 11) , SOM 阳性神经细胞 ( 图版 Ò : 14) 和 VIP 阳性神经细胞 ( 图版 Ò : 15) , 染 色较深, 分布散在; 在肠上皮, CGRP 阳性上皮细 胞 ( 图版 Ò : 11) 、calcit onin 上皮 细胞 ( 图版 Ò : 13) 和 VIP 阳性上皮细胞 ( 图版 Ò : 15) 、呈强阳 性反应, 分布于阴性上皮细胞之间。
动物学报 48( 5) : 641~ 647, 2002 A ct a Zoologica Sinica
十三种神经递质和神经肽在参环毛蚓神经系统 的分布: 免疫细胞化学研究*
罗振国 ¹** 赵 越 º 韩庆国 ¹ 张小云 ¹
( ¹ 深圳大学生物工程系, 广东深圳 518060) ( º 广东药学院药学系, 广州 510224)
对照实验: 以正常兔血清和 PBS 代替一抗分别 行替换对照和空白对照, 同步进行上述免疫组织化 学染色, 结果为阴性。 113 形态学测量
用装有目镜 网格的显微镜, 10 @ 10 放大 倍数 下, 分别计数抗体反应切片的脑、咽下wenku.baidu.com经节、腹 神经节和肠的阳性细胞, 每种抗体每个部位观察计 数 50 个视野。
摘 要 选择生活在我国的环节 动物门 典型代 表参环 毛蚓 ( Pher etima asp ergillum) 为研 究对象, 使用 13 种 抗 体, 运用免疫细胞化学染色技术, 在光学显微镜下观察神经递质和神经肽阳性细胞的形态与分布。研究发现在参 环毛蚓脑, ACT H 阳性神经细胞、AV P 阳性 神经细 胞、calcitonin 阳性 神经细 胞、CCK 阳性 神经细 胞、glutamate 阳性 神经细胞和 NP Y 阳性神经细胞染 色浓重, 分布密集, 位于脑的后侧半, 尤其特别的是在 calcitonin 阳性大 神 经细胞内含有粗大密集的分泌颗粒。B- EP 阳性神经细胞染 色较淡, OT 阳性神经 细胞染色 也较深, 但分 布稀疏, calbindin- D 、CGRP 、GA BA、SOM 、V IP 呈阴性反应; 在咽下神 经节与腹神经节, 仅有少量 AV P 阳性 神经细胞、 g lutamate 阳性神经细胞和 N PY 阳性神经细胞散在分布; 在肠神经系统, B- EP 阳性神经细胞、CGRP 阳性神经 细 胞、SOM 阳性神经细胞、VI P 阳性神经细胞染色较 深, 分布散在; 另 外, 在肠上皮, CGRP 阳性上 皮细胞、ca-l citonin 上皮细胞和 V IP 阳性上皮细胞 呈强阳性反应, 分布于 阴性上皮 细胞之 间。结果 表明参环 毛蚓神 经系统 存 在着 在其它环节动物所观察到的神经递质和神经肽: ACT H、VI P、B- endo rphin、CCK、N PY 、CGR P, 亦存在 着 文献 从未报道过的神经递质和神经 肽: calcitonin、AV P、OT 、glutamate、SOM , 其中 calcitonin、CGRP 、V IP 双 重分布于神经细胞和非神经组织的肠上皮细胞, 本文首次提供了形态学的证据。 关键词 参环毛蚓 神经递质 免疫细胞化学
3讨论
311 环节动物神经化学神经细胞的种类、分布特 点
哺乳动物的脑神经细胞是以功能性核团的形式 存在, 某个核团以一种或数种神经化学神经细胞为 主。严格来说, 环节动物并不具备真正的脑, 它所 谓的脑不过是个神经节而已, 它的脑不存在有功能 性核团, 神经化学神经细胞的分布较为弥散, 各种 神经化学神经细胞的分布 没有显著的区 域性。然 而, 环节动物的脑神经节在神经化学神经细胞的种 类、分布方面远较哺乳动物的神经节复杂。这是因 为环节动物的脑神经节某种程度上还起脑的作用, 指挥整体的活动。若将鼠神经节与环节动物的脑神 经节作一比较, 可以看出环节动物的脑神经节含有 种类较丰富的神经化学神经细胞。若就神经化学神 经细胞的形态进行比较, 鼠的下丘脑分泌神经细胞 分为两类, 一类为小细胞分泌神经细胞 ( parvoce-l lular neuroendocrine cells) , 呈锥形或三角形, 体积 较小, 具有典型的鹰眼样核; 另一类为大细胞分泌 神经细胞 ( magnocellular neuroendocrine cells) , 呈 圆形或 卵圆型, 体积 肥大, 核大 而偏位, 核仁清 楚。此类神经细胞主要分布在下丘脑室旁核、视上 核, 其纤维投射到神经垂体, 释放调节性神经递质 和神经肽入血循环。环节动物的某些递质能神经细 胞形态上与大细胞分泌神 经细胞类似, 也呈卵圆 型, 体积较大, 在 calcit onin 阳性大神 经细胞内含 有粗大密集的分泌颗粒。因此这些大神经细胞极可 能还是分泌性神经细胞。
哺乳动物神经系统中存在着约 40~ 50 余种神 经化 学 物 质 如 肽 类 和 氨 基 酸 递 质 ( Adelman, 1987) 。随着进化程度的降低, 无脊椎动物神经系 统存在的这些神经递质和神经肽的种类显著减少, 据目前文献报道, 在环节动物 的神经系统存 在约 10 余种, 它们是血管活性肠肽 ( vasoact ive intest-i nal polypept ide, VIP) ( Sundler et al . , 1977) 、促 肾上 腺 皮 质 激 素 ( adrenocort icotropin hormone, ACT H) 、P 物质 ( subst ance P , SP) ( Aros et al . , 1980) 、脑啡肽 ( enkephalin) 、B- 内啡肽 ( B- endorphin) ( Alumets et al . , 1979) 、促肾上腺皮质激素 释放 因 子 ( cort icotrophin releasing factor, CRF ) ( Remy et al . , 1982 ) 、 胆 囊 收 缩 素 ( cholecyst okinin, CCK) ( Lkhider et al . , 1987) 、神经肽 Y ( neuropept ide Y, NPY) 、降钙素基因相关肽 ( ca-l cit onin gene- related pept ide, CGRP ) 、 5-羟 色 胺 ( seret onin, 5-HT ) ( Csoknya et al . , 1992) 和胃泌 素 ( gast rin, GS) ( Reglodi, et al . , 1999) 。鉴于缺