酵母双杂交

• 挑取生长在四缺上的菌株提质粒，测序， 基因组比对，在进行后续工作。
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实验基本步骤
• 将已知基因与合适的DNA结合结构域（BD DNA序列）融合，构建成诱饵载体，转入 缺乏报告基因启动子的酵母菌菌株中，选 择被转化的菌株（Y2H）。
• 将未知基因与合适的转录激活域（AD DNA 序列）融合，构建成文库质粒，并转入酵 母菌中，即酵母菌文库（Y187）
• 将诱饵菌株与酵母文库混合培养。如果基因间有 互作会，会形成三叶草型的菌体，并诱导下游的 报告基因表达，能够在缺陷型培养基上生长。
酵母双杂交
蛋白质————蛋白质
基本思想
• 酵母双杂交是1989年由Fields提出并研究酵母 菌的Gal4转录因子。 • Gal4转录因子包括两个彼此分离的结构域， DNA-BD——DNA结合域（能够识别位于Gal4效 应基因的上游活话序列UAS）；AD——转录激 活域（识别转录机构中的其他成分） • DNA-BD、AD单独作用不能激活转录反应，但 是当二者在空间上充分接近时，呈现完整的 Gal4转录因子活性，启动下游基因的表达。
此时酵母菌通过蛋白的相互作用彼此粘合在一起
• 其中报告基因中包含控制-ade、-leu、-trp、 -his、MEL1、ABA等基因，Biat和Prey的结 合会导致BD、AD在空间上的拉近，具有激 活下游报告基因表达对功效。
• 当报告基因转录后，该菌株就能在一缺、 二缺、三缺、四缺培养基上生长。 （其中biat和prey结合的紧密程度，决定了其 是否能够激活更多的报告基因的表达）
谢谢
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
活化序列（UAS）结合，但不能引起转录。
然而，将一段具有转录激活活性的基因构
建到BD载体上，若其表达产生的 BD 单独与
UAS 结合也可以引起下游报告基因的转录，
那么就称之为酵母双杂中的自激活现象
自激活原理
GAL4BD Transcription factors
X
X
r e p o r t e r g e n e
两种重组质粒（含有目的基因（bait）+BD DNA序列、cDNA（prey）+AD DNA序列）分 别转入不同酵母菌中的。
AD+cDNA
BD+prey
在共培养的过程中会形成BD-Bait和AD-prey蛋白， 由于bait和prey之间的相互作用，使得BD、AD 彼此靠近，并激活报告基因的表达，使得该酵 母菌在不同的营养缺陷的培养基上表现出不同 的结果。
筛选阳性酵母的方法：在培养基中加入x-α-gal
X-α-Gal是一种酵母半乳糖酶 (MEL1) 的显色底物， 用于在培养基上直接检测GAL4系统的酵母双杂交作用。 通过蓝白颜色筛选，快速和简便地识别阳性的蓝色克
隆。
MEL1是GAL4酵母双杂交系统的一个报告基因
自激活现象——假阳性
一般情况下，单独的 BD 可以与 GAL4 上游