药物色谱分析-丁黎部分
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有些样品很容易吸附在进样阀和管路中，因此实验后要对柱子进行冲洗（纯水—纯甲醇）
ESI-MS为浓度型响应，因此柱后分流不影响响应信号
3、柱后补偿技术：在LC和MS要求的条件矛盾时用
调整pH值，达到尽量高的离子化效率；
加入异丙醇可加速含水多流动相的脱溶剂过程；
对无或若离子化能力分子，柱后加乙酸钠（50mol/L），使高效率产生［M+Na］+离子；
标准曲线法
将两组曲线斜率的平均值分别用S1和S2表示，计算基质效（ME）=|S1-S2|/S1
ME≤15 %，基质效应可忽略。
相对基质效应
通过对加入不同来源的某种生物基质中的待测物的质谱响应值进行比较获得。
变异系数CV%
消除方法
1、优化改进样品提取制备方法
与生物样品处理不干净有关，因而要选择合适的样品前处理方法
影响色谱柱展开的柱内柱外因素
液质连用LS-MS
离子源
接口：流动相及样品的雾化，除去溶剂分子；完成对样品的电离
大气压离子化API：使样品的离子化在处于大气压条件下的离子化室中完成。
电喷雾离子化ESI浓度型检测器
强电场影响下，对高度带电雾滴进行精细雾化的过程
A．雾滴形成过程：锥形-喷口模型
电场下正负离子的移动和表面张力制衡---形成Taylor锥----电压上升，带电雾滴释放
B．雾滴变小过程：雾滴—溶剂蒸发—小雾滴---达到Rayleigh稳定限---库仑爆炸
雾滴蒸发过程与雾滴起始尺寸和电荷相关。
决定雾滴半径的重要参数是流速和溶液导电率。低流速和高导电率产生细雾滴。
C．气相离子形成过程
1、分析物在溶液中的离子化对电喷雾技术很重要，碱性化合物的LC-ESI-MS分析，可选用酸性的流动相；相反碱性的流动相适用于一些酸性的化合物。使样品成离子状态。
4、选来自百度文库合适接口
a.APCI的基质效应小于ESI
b.正离子检测模式和负离子检测模式的比较，一般负离子的背景噪音要小
5、选择合适内标
理想的内标化合物应与待测组分在样品制备、色谱分离和质谱检测的全过程中具有相似的行为并且对待测组分的提取、测定无任何干扰，
以校正待测在移液、吹干、复溶等过程中的损失，待测组分由于基质效应影响所引起的响应信号的改变。
评价方法：
绝对基质效应
配制两组不同的系列浓度待测组分的标准曲线，每组5条。
第一组用流动相配制。
第二组将五种不同来源的空白生物样品提取后，加入药物配成与第一组相同浓度。
浓度水平法
将两组各浓度水平响应值分别用A和B表示，计算基质效应（ME）=B/A*100%
ME在85 % ~ 115 %，基质效应可忽略
可采用液-液萃取（LLE）、固相萃取（SPE）、蛋白沉淀（PP），并选择基质效应最小的。一般液-液萃取（LLE）的离子抑制作用往往最小
2、优化色谱条件
反相色谱中，极性成分往往是引起基质效应的主因。当色谱保留时间较短（＜3 min）时，受基质效应影响较大。因而有效增加色谱保留时间有利于减少基质效应。
3、减少进样体积——作用显著
待测物在气相中吸收由真空-紫外灯（UV lamp）发出的光（10 eV）后放出电子而离子化。
吸收光子而离子化
基于第一电离能大小
分析弱极性和极端非极性化合物
离子抑制小
基质效应极小
低流速相应好
增加真空紫外灯（氪气为多）
质量分析器按照核质比的不同分离
四级杆质量分析器
扫描方式：
全扫描SCAN：在给定的时间内不间断地对设定荷质比（m/z）范围内所有离子进行扫描。
利用柱后三通分流，降低进入离子源的流动相流量。
柱后衍生化。
应用“TFA-fix”技术解决三氟乙酸（TFA）对蛋白质信号的压抑作用，改善灵敏度。
（在生化色谱分析中，流动相中常加入1%的三氟乙酸（TFA），它能够增加色谱分辨率，但是TFA为较强离子对试剂，使蛋白质不易产生［M+H］+，信号减弱。可柱后添加沸点高但离子对作用弱的丙酸或乙酸。由于沸点：丙酸＞乙酸＞三氟乙酸。溶剂蒸发中，TFA被丙酸或乙酸取代，易于产生［M+H］+）
但柱选择项-色谱柱性质，柱容量项--柱温。2
在液相色谱中，柱选择项和柱容量项也都与色谱柱及流动相的性质相关2
但柱选择项---流动相的种类。1
k变小，谱带流出较早，分离度变差；k变大，分离度增加。
但是当k= 5～6时，对分离度的贡献已基本上达到最大，再增加对分离度已无多大贡献。
高PA的待测物通常是通过与质子化的溶剂发生质子转移反应来达到离子化，低PA的待测物是通过与添加剂发生电荷交换反应来离子化。
添加剂：甲苯，丙酮，苯甲醚
ESI电喷雾离子化
样品溶液通过具有高静电梯度（约3kV/cm）的喷雾毛细管时，发生静电喷雾，并在干燥气中形成带电雾滴，随着溶剂的蒸发，生成气态离子，气态离子沿着电压和压力梯度进入锥孔到达质量分析器进行分析。
惰性气体
扫描（范围减小）
药物二次代谢产物分析
碰撞后丢失一定中性质量的前体离子谱图
质荷比轴数据来自MS1，离子强度轴数据来自MS2
选择反应监测
固定
惰性气体
固定
定量分析，混合组分痕量分析
产生特定产物离子的某特定前体离子的谱图
色谱条件选择注意事项：
1、流动相：
水相的选择：优先使用低水比例的溶液为流动相，水含量高降低离子化效果。
用于测定未知化合物的或未知混合物中各组分的分子量和质谱图。
用于未知化合物的定性分析
进行SIM前，用SCAN确定扫描的目标离子及其最佳电离参数
选择离子检测SIM：在给定的时间内选择性地扫描某一个或几个选定荷质比的离子，得到的不是化合物全谱。
主要用于定量分析，快速筛选目标化合物。
三级四级杆质量分析器
扫描方式
测碱性物质，pH值在（pKa - 2），正离子检测
测酸性物质，pH值在（pKa + 2），负离子检测
C18柱适合2-8
常用：醇-水，乙腈-水，甲醇-乙腈-水
2、流速和色谱柱内径：流动相流速受柱子内径和流动相组成影响。
较小的流速可获得较好离子化效率。因而尽量选内径小的色谱柱。
但是要兼顾分析速度的因素，因此多采用内径2.1mm的色谱柱，0.2~0.4ml/min的流速。
不适于热不稳定(可能发生热裂解)、难于气化的极性和大分子化合物
离子化过程对流动相组成依赖小，离子抑制较小。
水的比例不限。
PH有一定影响
基质效应小
高流速范围响应更好。
≤2 ml/mim
正相色谱易于连接
软电离方式
增加电晕放电针：发射自由电子启动后续离子化过程。
增加APCI蒸发器：对喷雾气体进行加热
APPI大气压光离子化
通过喷口与毛细管间的高电压离子化
产生多电荷离子
基于质子亲和力大小
适于中、强极性化合物
蛋白质、肽类、低聚核苷酸等生物分子；胺类、季铵盐等；含杂原子化合物如氨基甲酸酯等
不适合非极性化合物，如烷烃、苯等
离子抑制作用较强，因此对流动相组成有要求，避免表面活性高的试剂。
PH影响大
基质效应大
低流速范围响应更好。
定量限LOQ：信噪比为10:1时确定
分离度评价计算
对于两个等面积峰
R= 1：基本分离
R= 1.5：基线分离
《中华人民共和国药典》要求“除另有规定，分离度应大于1.5”。
影响因素：
分离度方程
柱效项主要与理论塔板数相关，柱选择项和柱容量项相互关联
在气相色谱中，柱选择项和柱容量项虽然都与色谱柱的性质相关1
APCI对流动相组成要求小，可接受高水比例流动相
有机相的选择：提高有机相比例可提高离子化效率。
一般正离子方式用甲醇，负离子方式用乙腈
缓冲盐的选择：非挥发性盐和离子对试剂与LC/MS不匹配(竞争抑制)
选用挥发性酸、碱和盐，如醋酸铵、甲酸铵、甲酸、乙酸、氨水等。为了离子化效果，以上电解质浓度宜小。
pH的选择：pH值影响离子化状态，影响生成气相离子的效率和检测灵敏度。
2、表面张力过大，难以形成锥形；而电压过大，容易放电形成簇离子。因此选用表面张力小的溶剂，如甲醇，乙腈。三低：表面张力低，黏度低，流速低
3、去溶剂的程度：提高干燥器的温度，流速
4、“竞争机制”：一般而言,样品信号强度随着其它电解质浓度的增高而降低.
表面竞争，电荷竞争
大气压化学离子化APCI软电离方式
MS1（前体离子）
碰撞室
MS2（产物离子）
作用
产物离子扫描
固定
惰性气体
扫描
化合物结构推断
某核质比的前体离子的产物离子谱图
前体离子扫描
全扫描
惰性气体
固定
药物降解产物，代谢物结构鉴定，同系物分析
产生某核质比产物离子的前体离子谱图
质荷比轴数据来自MS1，离子强度轴数据来自MS2
中性丢失扫描
扫描（一定范围）
≤1 ml/mim
线性范围较APCI窄。
软电离方式
APCI大气压化学离子化
在大气压条件下采用电晕放电的方式使流动相离子化，然后流动相作为化学离子反应气（气相试剂）使样品离子化的技术。样品分子的离子化通过质子化或电荷转移来完成。
电晕放电启动化学离子化
单电荷离子。
基于质子亲和力大小
适于非极性、中等极性小分子。
质谱条件选择注意事项：
1、离子化方式选择：ESI APCI APPI
2、离子极性的选择：碱性物质：流动相加甲酸或乙酸，成正离子，正离子检测方式。
酸性物质：负离子检测方式。
3、分子离子的判断和碎片离子的选择
分子离子的判断
正离子检测方式时，加入Li+，则产生[M＋Li]+，m/z值比分子离子大6。
伪分子离子均可帮助判断，如[M＋H]+，[M＋Li]+和[M＋Na]+，分别大了6，22，38
稳定同位素标记物
FDA在生物样品分析方法确证中对基质效应的规定
——凡是使用液质建立生物样品分析方法时，必须考察基质效应对化合物测定的影响。当基质的影响控制在LLOQ的20%以下，这个方法才能被接受。
色谱分析方法验证：
准确度
回收率RE% 98-102%
精密度：RSD<2%
检测限LOD：信噪比为3:1时确定
与ESI比较，增加电晕放电针：发射自由电子启动后续离子化过程
增加APCI蒸发器：对喷雾气体进行加热
APCI是软的电离方式，由于溶剂蒸汽的保护，样品分子较少受热裂解的影响，大量的热量用于溶剂的蒸发，电离过程属于离子-分子反应。
大气压光离子化APPI
要求待测物的第一电离能小于10eV，而大部分气体和溶剂的电离能大于10eV，因而背景干扰低
4、单级四极杆质谱中检测离子的选择
酸性化合物：[M-H]-或其碎片离子
碱性化合物：[M＋H]+或其碎片离子
酸碱两性：流动相加甲酸或乙酸成[M＋H]+
基质效应：是指由于样品中存在的干扰物质，对响应造成的直接或间接的影响。
内源性物质使待测物的离子化效率降低或者增强。
APCI基质效应小于ESI,而APPI的基质效应更小
ESI-MS为浓度型响应，因此柱后分流不影响响应信号
3、柱后补偿技术：在LC和MS要求的条件矛盾时用
调整pH值，达到尽量高的离子化效率；
加入异丙醇可加速含水多流动相的脱溶剂过程；
对无或若离子化能力分子，柱后加乙酸钠（50mol/L），使高效率产生［M+Na］+离子；
标准曲线法
将两组曲线斜率的平均值分别用S1和S2表示，计算基质效（ME）=|S1-S2|/S1
ME≤15 %，基质效应可忽略。
相对基质效应
通过对加入不同来源的某种生物基质中的待测物的质谱响应值进行比较获得。
变异系数CV%
消除方法
1、优化改进样品提取制备方法
与生物样品处理不干净有关，因而要选择合适的样品前处理方法
影响色谱柱展开的柱内柱外因素
液质连用LS-MS
离子源
接口：流动相及样品的雾化，除去溶剂分子；完成对样品的电离
大气压离子化API：使样品的离子化在处于大气压条件下的离子化室中完成。
电喷雾离子化ESI浓度型检测器
强电场影响下，对高度带电雾滴进行精细雾化的过程
A．雾滴形成过程：锥形-喷口模型
电场下正负离子的移动和表面张力制衡---形成Taylor锥----电压上升，带电雾滴释放
B．雾滴变小过程：雾滴—溶剂蒸发—小雾滴---达到Rayleigh稳定限---库仑爆炸
雾滴蒸发过程与雾滴起始尺寸和电荷相关。
决定雾滴半径的重要参数是流速和溶液导电率。低流速和高导电率产生细雾滴。
C．气相离子形成过程
1、分析物在溶液中的离子化对电喷雾技术很重要，碱性化合物的LC-ESI-MS分析，可选用酸性的流动相；相反碱性的流动相适用于一些酸性的化合物。使样品成离子状态。
4、选来自百度文库合适接口
a.APCI的基质效应小于ESI
b.正离子检测模式和负离子检测模式的比较，一般负离子的背景噪音要小
5、选择合适内标
理想的内标化合物应与待测组分在样品制备、色谱分离和质谱检测的全过程中具有相似的行为并且对待测组分的提取、测定无任何干扰，
以校正待测在移液、吹干、复溶等过程中的损失，待测组分由于基质效应影响所引起的响应信号的改变。
评价方法：
绝对基质效应
配制两组不同的系列浓度待测组分的标准曲线，每组5条。
第一组用流动相配制。
第二组将五种不同来源的空白生物样品提取后，加入药物配成与第一组相同浓度。
浓度水平法
将两组各浓度水平响应值分别用A和B表示，计算基质效应（ME）=B/A*100%
ME在85 % ~ 115 %，基质效应可忽略
可采用液-液萃取（LLE）、固相萃取（SPE）、蛋白沉淀（PP），并选择基质效应最小的。一般液-液萃取（LLE）的离子抑制作用往往最小
2、优化色谱条件
反相色谱中，极性成分往往是引起基质效应的主因。当色谱保留时间较短（＜3 min）时，受基质效应影响较大。因而有效增加色谱保留时间有利于减少基质效应。
3、减少进样体积——作用显著
待测物在气相中吸收由真空-紫外灯（UV lamp）发出的光（10 eV）后放出电子而离子化。
吸收光子而离子化
基于第一电离能大小
分析弱极性和极端非极性化合物
离子抑制小
基质效应极小
低流速相应好
增加真空紫外灯（氪气为多）
质量分析器按照核质比的不同分离
四级杆质量分析器
扫描方式：
全扫描SCAN：在给定的时间内不间断地对设定荷质比（m/z）范围内所有离子进行扫描。
利用柱后三通分流，降低进入离子源的流动相流量。
柱后衍生化。
应用“TFA-fix”技术解决三氟乙酸（TFA）对蛋白质信号的压抑作用，改善灵敏度。
（在生化色谱分析中，流动相中常加入1%的三氟乙酸（TFA），它能够增加色谱分辨率，但是TFA为较强离子对试剂，使蛋白质不易产生［M+H］+，信号减弱。可柱后添加沸点高但离子对作用弱的丙酸或乙酸。由于沸点：丙酸＞乙酸＞三氟乙酸。溶剂蒸发中，TFA被丙酸或乙酸取代，易于产生［M+H］+）
但柱选择项-色谱柱性质，柱容量项--柱温。2
在液相色谱中，柱选择项和柱容量项也都与色谱柱及流动相的性质相关2
但柱选择项---流动相的种类。1
k变小，谱带流出较早，分离度变差；k变大，分离度增加。
但是当k= 5～6时，对分离度的贡献已基本上达到最大，再增加对分离度已无多大贡献。
高PA的待测物通常是通过与质子化的溶剂发生质子转移反应来达到离子化，低PA的待测物是通过与添加剂发生电荷交换反应来离子化。
添加剂：甲苯，丙酮，苯甲醚
ESI电喷雾离子化
样品溶液通过具有高静电梯度（约3kV/cm）的喷雾毛细管时，发生静电喷雾，并在干燥气中形成带电雾滴，随着溶剂的蒸发，生成气态离子，气态离子沿着电压和压力梯度进入锥孔到达质量分析器进行分析。
惰性气体
扫描（范围减小）
药物二次代谢产物分析
碰撞后丢失一定中性质量的前体离子谱图
质荷比轴数据来自MS1，离子强度轴数据来自MS2
选择反应监测
固定
惰性气体
固定
定量分析，混合组分痕量分析
产生特定产物离子的某特定前体离子的谱图
色谱条件选择注意事项：
1、流动相：
水相的选择：优先使用低水比例的溶液为流动相，水含量高降低离子化效果。
用于测定未知化合物的或未知混合物中各组分的分子量和质谱图。
用于未知化合物的定性分析
进行SIM前，用SCAN确定扫描的目标离子及其最佳电离参数
选择离子检测SIM：在给定的时间内选择性地扫描某一个或几个选定荷质比的离子，得到的不是化合物全谱。
主要用于定量分析，快速筛选目标化合物。
三级四级杆质量分析器
扫描方式
测碱性物质，pH值在（pKa - 2），正离子检测
测酸性物质，pH值在（pKa + 2），负离子检测
C18柱适合2-8
常用：醇-水，乙腈-水，甲醇-乙腈-水
2、流速和色谱柱内径：流动相流速受柱子内径和流动相组成影响。
较小的流速可获得较好离子化效率。因而尽量选内径小的色谱柱。
但是要兼顾分析速度的因素，因此多采用内径2.1mm的色谱柱，0.2~0.4ml/min的流速。
不适于热不稳定(可能发生热裂解)、难于气化的极性和大分子化合物
离子化过程对流动相组成依赖小，离子抑制较小。
水的比例不限。
PH有一定影响
基质效应小
高流速范围响应更好。
≤2 ml/mim
正相色谱易于连接
软电离方式
增加电晕放电针：发射自由电子启动后续离子化过程。
增加APCI蒸发器：对喷雾气体进行加热
APPI大气压光离子化
通过喷口与毛细管间的高电压离子化
产生多电荷离子
基于质子亲和力大小
适于中、强极性化合物
蛋白质、肽类、低聚核苷酸等生物分子；胺类、季铵盐等；含杂原子化合物如氨基甲酸酯等
不适合非极性化合物，如烷烃、苯等
离子抑制作用较强，因此对流动相组成有要求，避免表面活性高的试剂。
PH影响大
基质效应大
低流速范围响应更好。
定量限LOQ：信噪比为10:1时确定
分离度评价计算
对于两个等面积峰
R= 1：基本分离
R= 1.5：基线分离
《中华人民共和国药典》要求“除另有规定，分离度应大于1.5”。
影响因素：
分离度方程
柱效项主要与理论塔板数相关，柱选择项和柱容量项相互关联
在气相色谱中，柱选择项和柱容量项虽然都与色谱柱的性质相关1
APCI对流动相组成要求小，可接受高水比例流动相
有机相的选择：提高有机相比例可提高离子化效率。
一般正离子方式用甲醇，负离子方式用乙腈
缓冲盐的选择：非挥发性盐和离子对试剂与LC/MS不匹配(竞争抑制)
选用挥发性酸、碱和盐，如醋酸铵、甲酸铵、甲酸、乙酸、氨水等。为了离子化效果，以上电解质浓度宜小。
pH的选择：pH值影响离子化状态，影响生成气相离子的效率和检测灵敏度。
2、表面张力过大，难以形成锥形；而电压过大，容易放电形成簇离子。因此选用表面张力小的溶剂，如甲醇，乙腈。三低：表面张力低，黏度低，流速低
3、去溶剂的程度：提高干燥器的温度，流速
4、“竞争机制”：一般而言,样品信号强度随着其它电解质浓度的增高而降低.
表面竞争，电荷竞争
大气压化学离子化APCI软电离方式
MS1（前体离子）
碰撞室
MS2（产物离子）
作用
产物离子扫描
固定
惰性气体
扫描
化合物结构推断
某核质比的前体离子的产物离子谱图
前体离子扫描
全扫描
惰性气体
固定
药物降解产物，代谢物结构鉴定，同系物分析
产生某核质比产物离子的前体离子谱图
质荷比轴数据来自MS1，离子强度轴数据来自MS2
中性丢失扫描
扫描（一定范围）
≤1 ml/mim
线性范围较APCI窄。
软电离方式
APCI大气压化学离子化
在大气压条件下采用电晕放电的方式使流动相离子化，然后流动相作为化学离子反应气（气相试剂）使样品离子化的技术。样品分子的离子化通过质子化或电荷转移来完成。
电晕放电启动化学离子化
单电荷离子。
基于质子亲和力大小
适于非极性、中等极性小分子。
质谱条件选择注意事项：
1、离子化方式选择：ESI APCI APPI
2、离子极性的选择：碱性物质：流动相加甲酸或乙酸，成正离子，正离子检测方式。
酸性物质：负离子检测方式。
3、分子离子的判断和碎片离子的选择
分子离子的判断
正离子检测方式时，加入Li+，则产生[M＋Li]+，m/z值比分子离子大6。
伪分子离子均可帮助判断，如[M＋H]+，[M＋Li]+和[M＋Na]+，分别大了6，22，38
稳定同位素标记物
FDA在生物样品分析方法确证中对基质效应的规定
——凡是使用液质建立生物样品分析方法时，必须考察基质效应对化合物测定的影响。当基质的影响控制在LLOQ的20%以下，这个方法才能被接受。
色谱分析方法验证：
准确度
回收率RE% 98-102%
精密度：RSD<2%
检测限LOD：信噪比为3:1时确定
与ESI比较，增加电晕放电针：发射自由电子启动后续离子化过程
增加APCI蒸发器：对喷雾气体进行加热
APCI是软的电离方式，由于溶剂蒸汽的保护，样品分子较少受热裂解的影响，大量的热量用于溶剂的蒸发，电离过程属于离子-分子反应。
大气压光离子化APPI
要求待测物的第一电离能小于10eV，而大部分气体和溶剂的电离能大于10eV，因而背景干扰低
4、单级四极杆质谱中检测离子的选择
酸性化合物：[M-H]-或其碎片离子
碱性化合物：[M＋H]+或其碎片离子
酸碱两性：流动相加甲酸或乙酸成[M＋H]+
基质效应：是指由于样品中存在的干扰物质，对响应造成的直接或间接的影响。
内源性物质使待测物的离子化效率降低或者增强。
APCI基质效应小于ESI,而APPI的基质效应更小