A549细胞培养方法

A549细胞的培养

A549细胞为人肺腺癌细胞，属于传代细胞系，可稳定地传代培养。一般用胰酶消化后，加入生长液稀释，以1:2~1:3传代培养都是可行的。

一、[所需溶液]

1、细胞冲洗液：磷酸盐缓冲液（PBS）——无Ca2+、Mg2+

NaCl 8.00 g；

KCl 0.20 g;

KH2PO4 0.20 g;

Na2HPO4·12H2O 1.15 g

加水至1000mL，将pH调至7.4，高压灭菌。

2、消化液

（1）胰酶-PBS

结晶胰酶 2.5 g;

高压灭菌后的PBS 1000 ml

用磁力搅拌器搅拌均匀，使其完全溶解，通过0.22 μm的滤膜过滤除菌，分装备用，放置-20℃保存。

（2）胰酶—EDTA:

结晶胰酶 0.5 g;

EDTA盐溶液 0.2 g

无Ca2+、Mg2+ PBS 1000 ml

用磁力搅拌器搅拌均匀，使其完全溶解，通过0.22 μm的滤膜过滤除菌，分装备用，放置-20℃保存。

3、细胞培养液：RPMI 1640培养液

配制方法：

（1）将一袋干粉型RPMI 1640培养基溶于900 ml三蒸水中，冲洗包装袋两至三次倒入培养液中。

（2）加入丙酮酸钠 0.1 g，NaHCO2 2 g以及双抗，加入磁力搅棒并置于磁力搅拌器上充分搅拌。双抗的配置浓度为 100 U/ml 青霉素和100 U/ml链霉素。（一般市售的青霉素为80 万U/瓶，将其溶解于4 ml三蒸水中，每升培养液中加入0.5 ml；市售的链霉素为100 万U/瓶，将其溶解于5 ml三蒸水中，每升培养液中加入0.5 ml）。

（3）调整培养液的pH值，用pH精密试纸观察pH 7.2~7.4即可。

（4）过滤法除菌，所使用的滤器为O2加压过滤，0.22 μm滤膜，滤膜事先采用高压灭菌消毒。

（5）分装，加盖瓶塞，加封纱布报纸，用绳固定，放置-20℃保存。

二、［细胞的维持和培养］

1、细胞的复苏

（1）准备一个盛有37℃温水的烧杯，从液氮罐中取出存有A549细胞的冻存管，放于37℃温水中，用镊子夹住轻轻摇动使其迅速融化。

（2）1000~2000 r，3~5 min离心。

（3）在无菌操作台中采用75%的乙醇彻底擦拭冻存管，然后打开冻存管，注意动作要轻柔。

（4）用1 ml枪头将上清液去除，加入1 ml预热的细胞培养液将细胞吹散开，转移至25cm2培养瓶中。

（5）补充4 ml的RPMI 1640培养基，并且添加10%的胎牛血清。

（6）倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2培养。

（7）24h后，更换新的培养液。

（8）常规传代培养。

2、A549细胞更换新的培养液

（1）无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。

（2）用PBS反复冲洗细胞2~3遍。

（3）加入新鲜的预热好的培养液及10%的胎牛血清。

各种液体需要量（ml）

（4）倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2培养。

3、A549细胞的传代

（1）无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。

（2）向已经长满的细胞中加入消化液1 ml，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有的细胞表面，吸弃或倒掉，轻轻冲洗细胞表面2~3遍，以尽可能去除原培养液中的牛血清。

（3）加入1 ml消化液，在37℃培养箱中孵育5~8 min后把培养瓶放置在倒置显微镜下观察，发现细胞的胞质回缩、胞间质增大后，立即终止消化。

（4）加入5 ml预热至37℃的培养液，用玻璃吸管反复吹打以分散细胞。吹打过程按顺序进行，从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有的底部都被吹到。

（5）吸取一半的细胞悬液，接种到新的25 cm2培养瓶中，补足培养液，并且添加10%~20%的胎牛血清。通常每瓶液体量为5~10 ml。

（6）倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2培养。

注意事项：

（1）所有液体在加入细胞瓶前均应预热到37℃。所有液体均应调整pH至7.2左右，均不能超过7.4。

（2）细胞消化传代时吹打不要产生气泡，吹打力量不宜过多，否则会损伤细胞。

（3）严格执行无菌操作的要求。

（4）尽可能减少消化液剩余量，过多时会对细胞产生损伤，可多添加些含牛血清的培养液中和。

（5）培养瓶在室温中放置时间应尽可能短。

4、A549细胞的冻存

（1）消化已生长融合的单层细胞。

（2）用生长液悬浮细胞，并且添加10%的FCS和10%DMSO（二甲基亚砜）。分装在2 ml容积的冻存管中。

（3）用本实验室自制的冻存包包裹好冻存管，放在-70℃冰箱中过夜。

（4）放入液氮中冻存。