脱氢酶的测定

活性污泥脱氢酶活性的测定

1 目的和原理

有机物在生物处理构筑物中的分解，是在酶的参与下实现的，在这些酶中脱氢酶占有重要的地位，因为有机物在生物体内的氧化往往是通过脱氢来进行的。活性污泥中脱氢酶的活性与水中营养物浓度成正比，在处理污水过程中，活性污泥脱氨酶活性的降低，直接说明了污水中可利用物质营养浓度的降低。此外，由于酶是一类蛋白质，对毒物的作用非常敏感，当污水中有毒物存在时，会使酶失活，造成污泥活性下降。在生产实践中，我们常常在设置对照组，消除营养物浓度变化影响因素的条件下，通过测定活性污泥在不同工业废水中脱氢酶活性的变化情况来评价工业废水成分的毒性，评价对不同工业废水的生物可降解性。

脱氢酶是一类氧化还原酶，它的作用是催化氢从被氧化的物体（基质AH）中转移到另一个物体（受氢体B）上：

为了定量地测定脱氢酶的活性，常通过指示剂的还原变色速度，来确定脱氢过程的强度。常用的指示剂有2,3,5－三苯基四氮唑氯化物（TTC）或亚甲蓝，它们在从氧化状态接受脱氢酶活化的氢而被还原时具有稳定的颜色，我们即可通过比色的方法，测量反应后颜色深度，来推测脱氢酶的活性。例如：

TTC（无色）TF（红色）

2 材料与器皿

（1）72型分光光度计、超级恒温器、离心机（4000转／分）、15毫升离心管、移液管、黑布罩

（2）试剂：

①Tris－HCl缓冲液（0.05M）：称取三羟甲基氨基甲烷6.037克，加1.0MHCl 20毫升，蒸馏水定容至1L，pH为8.4。（备注M指mol/L）

②氯化三苯基四氮唑（TTC）（0.4％）：称取0.4克TTC溶于100毫升蒸馏水中，即成0.4％的TTC溶液（每周新配）。

③亚硫酸钠（0.36％）：称0.3657克亚硫酸钠溶于100毫升蒸馏水中。

④丙酮、甲醛（分析纯）。

⑤10%硫化钠：称取10克硫化钠（分析纯），定容至100mL棕色容量瓶中.

⑥0.1mol／L葡葡萄糖溶液：称取1．98179葡萄糖(分析纯)溶于100mL蒸馏水。

3 方法与步骤

（1）标准曲线的制备

①配制1mg/毫升TTC溶液：称取50.0mgTTC，置于50毫升容量瓶中，以

蒸馏水定容至刻度

②配制不同浓度TTC液：从1mg/毫升TTC液中分别吸取1、2、3、4、5、

6、7毫升放入每个容积为50毫升的一组容量瓶中，以蒸馏水定容至50毫升，各瓶中TTC浓度分别为20、40、60、80、100、120、140μg/毫升。

③每只带塞离心管内加入Tris-HCl缓冲液2毫升＋2毫升蒸馏水＋1毫升TTC液（从低到高浓度依次加入）；对照管加入2毫升Tris-HCl缓冲液+3毫升蒸馏水，不加入TTC，所得每只离心管TTC含量分别为20、40、60、80、100、120、140μg。

④每管各加入1mL的10%硫化钠溶液，混合置于暗处20min，使TTC全部还原，生成红色的TF。

⑤在各管加入5毫升丙酮（或正丁醇和甲醇），抽提TF。

⑥放入37℃恒温振荡萃取10min。

⑦在4000转/分下，离心10分钟。

⑧在721型分光光度计上，于485nm波长下测光密度。

⑨测绘标准曲线。

将标准曲线测定时的数值填入表5－8中。

表5－8 标准曲线OD实测值

备注：根据上表数据以TTC为横座标，OD值为纵座标绘制标准曲线。（2）活性污泥脱氢酶活性的测定

①活性污泥悬浮液的制备：

取活性污泥混合液50毫升玻璃珠振荡破碎后，在在4000转/分下，离心5分钟弃去上清液，蒸馏水补足，充分搅拌洗涤后，再次离心弃去上清液；如此反复洗涤三次后再以蒸馏水稀释至原来体积备用。

②在三组（每组三支）带有塞的离心管内分别加入以下材料与试剂（如表5－7所示）。

③样品试管摇匀后，立即放入37℃恒温水浴振荡仪内，培养2h。

④取出加入0.5mL甲醛终止反应。

⑤在对照管与样品管中各加入丙酮5毫升，充分摇匀，放入37℃恒温振荡萃取10min。

⑥在4000转/分下，离心10分钟。

⑦取上清夜在485纳米波长下比色，光密度OD读数应在0.8以下，如色度过浓应以丙酮稀释后再比色。

⑧标准曲线上查TF的产生值，并算得脱氢酶的活性。

表5－7 脱氢酶活性测定中各组试剂加量

4 结果与分析

（1）活性污泥脱氢酶活性的测定

①将样品组的OD值（平均值）减去对照组OD值后，在标准曲线上查TF 的产生值。

②算得样品组（加基质与不加基质）的脱氢酶活性X（以产生微克／毫升活性污泥·小时表示）：

X（TFμg/L活性污泥·小时）＝A ×B ×C

式中：

X——脱氢酶活性

A——标准曲线上读数

B——反应时间校正= 60分钟/实际反应时间

C——比色时稀释倍数