ZSCI肿瘤干细胞培养技术
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
CD133+
CD45−, CD90+
CD133+, CD44+, CD26+, ALDH
References
PMID: 21318290 PMID: 19858069 PMID: 16449977 PMID: 12629218 PMID: 18775674 PMID: 15549107 PMID: 18567795
1,000
0.25
24
100
1
96
1
2
192
-彻底的混匀细胞悬液，根据上表在96孔细胞培养板中加入细胞悬液（200μL/well）； -利用显微镜观察，标记出含有单个细胞的培养板孔； -2~4周后，观察形成肿瘤球的培养板孔； -计算CSC形成肿瘤球的频率 （Analysis software: .au/software/elda/）
23
-In vivo CRC LDA
2.2 结直肠癌干细胞培养
Serially dilute cells so that you have the following final cell concentrations Tube 1 (50,000 cells/injection): 600,000 cells in 360 μL media Tube 2 (10,000 cells/injection): 120,000 cells in 360 μL media Tube 3 (1,000 cells/injection): 12,000 cells in 360 μL media Tube 4 (100 cells/injection): 1200 cells in 360 μL media Tube 5 (10 cells/injection): 120 cells in 360 μL media
16
2.1 乳腺癌干细胞培养
实验步骤（Procedure）：
3. 对细胞进行拍照，一般0d, 2d, 4d, 6d或0d, 1d, 3d, 5d, 7d进行拍照；
MDA-MB-231 CSCs
MDA-MB-231
4T1 CSCs
前期长势慢，后期快，一般一周左右传代一次，中途需添加CSCs培养基。
17
5
1.2 肿瘤干细胞特征
3. CSCs对治疗耐受8。
CSCs耐受的主要机制包括： 1）药物外排（ABC-transporters） 2）抗凋亡通路 3）干扰细胞分化 4）乙醛脱氢酶（ALDH） 5）缺氧环境 6）DNA损伤反应 7）周期静止 8）促生存信号通路
Ref: 8Drug Discov Today, PMID: 24819719
bFGF （Prospec）
P/S （gbico）
B27 （gibco）
Insulin （Genview）
BSA （sigma）
氢化可的松注射液 （天津金耀）
15
2.1 乳腺癌干细胞培养
实验步骤（Procedure）：
1. 配置乳腺癌干细胞培养基（BCSCs culture media）；
Total volume: 50 mL
Cancer stem cells 19
2.1 乳腺癌干细胞培养
实验步骤（Procedure）：
-检测CSC自我更新能力（PMID: 28214331）
-检测CSC上皮间充质转化（EMT）相 关指标：E-cadherin/snail and Ncadherin/Vimentin，检测得比较少，可 不检测（PMID: 30188754）
2. CSCs具有一些干细胞特征，包括：休眠、DNA修复机制激活、药物转运蛋白 （ABC）表达以及对细胞凋亡天然抗性7。
Refs: 4Histopathology, PMID: 19723143; 5Nat Cell Biol, PMID: 20418870; 6Cell, PMID: 18485877; 7Cancer Res, PMID: 14583474
2.1 乳腺癌干细胞培养
实验步骤（Procedure）：
4. 裸鼠移植瘤实验检测 CSCs成瘤能力（对比普通 肿瘤细胞和CSCs）；
接种细胞密度不一致： CSCs可比普通肿瘤细胞接 种密度低2~3个数量级，呈 梯度增加。
Attentions: -建议体内成瘤实验之前先流式细胞术检测所培养肿瘤干细胞中肿瘤干细胞标志物，如乳 腺癌干细胞标志物CD44+、CD24-等，既能说明培养方式未使肿瘤干细胞分化或分化较少 ，又能保证移植瘤实验的成功率； -裸鼠移植瘤实验皮下成瘤即可，原位移植瘤更好； -既要关注移植瘤成瘤率，还要关注移植瘤成瘤时间。
LUNG
Prostate cancer
Cell surface marker
CD20+, CD271+ CD44+, CD24+
CD133+
CD44+, ALDH1
CD133+, CD90, CD117, ALDH1 CD44+, CD133+, CD49
References
PMID: 16230395 PMID: 17122772 PMID: 17122772
6
1.3 肿瘤干细胞分离
FACS（荧光激活细胞分选术）和MACS（磁珠细胞分选）是分选CSCs的主 要技术。
FACS：通过细胞水平特殊蛋白表达、细胞培养、表观遗传学变化以及CD24 、CD133、CD44等细胞水平标志物的表达方式来分离细胞。
MACS：干细胞分离标准方法，根据特殊干细胞标志物（如CD133）的表达 分离细胞。
CSCs的存在最早是在40年前被提出来的，支持CSCs存在的最佳证据来源于 对恶性血液性疾病的研究2,3。TPC (Tumor Propagating Cell) = CSCs。
Refs: 1Stem Cell Discovery, 2014, 4, 83-89; 2Nature, PMID: 7509044;
(1) DMEM/F-12; (2) B27;
(3) EGF;
(4) bFGF;
(5) BSA;
(6) Insulin;
(7) Hy;
(8) P/S.
2. 胰蛋白酶消化已分选肿瘤细胞，接种于超低黏附培养板；
梯度稀释：
接种于超低黏附6孔培养板， 1000~20000 cells/4 mL, 以确定 后期需要传代的密度及生长周 期。
18
2.1 乳腺癌干细胞培养
实验步骤（Procedure）：
5. 体外检测CSC相关因子及干细胞标志物等； -检测CSC生物标志物：CD44/CD24/ALDH（PMID: 28376210）
-检测CSC干性相关因子：Nanog, Cancer cells Oct-4, Sox-2, and C-myc（PMID: 30188754）
3Methods Cell Biol, PMID: 18442654.
4
1.2 肿瘤干细胞特征
1. CSCs的迁移对转移的影响。CD133+胰腺癌细胞具有形成肿瘤的能力；这些 细胞能够连续传代，说明其具有自我更新能力，且能够通过制造分化的、非致瘤 的子代产生肿瘤异质性4。 EMT（上皮间充质转化）-信号通路相关（如Wnt信号通路5）；经历EMT过程的 肿瘤细胞呈现CSC特性6。
流式细胞仪
免疫磁珠分选装置
7
1.4 肿瘤干细胞标志物
Tumor type
Acute myeloid leukemia (AML)
Breast cancer
Ovarian cancer
Glioblastoma
Medulloblastoma Small cell and nonesmall cell lung cancer
11
2 肿瘤干细胞培养技术
另外一种细胞分选方法为MACS，操作简便，但是一次只能够分选一个标志物。
1. 特异性免疫磁珠标签于肿瘤 细胞：带CSC标志物的细胞将 会被带有标签； 2. 用磁珠分选装置分选细胞： 将带有磁珠的细胞吸附于分选 装置上，其余细胞将被洗脱； 3. 将靶标细胞从分选装置上洗 脱。
CD133, CD44, and et al.（PMID: 21948564）
21
2.2 结直肠癌干细胞培养
3. Extreme Limiting Dilution Analysis（ELDA, 极限稀释法）检测CSC干性特征； -In vitro CRC LDA
Serially dilute cells to obtain the following final cell concentrations Tube 1 (1,000 cells/well): 27,000 cells in 5.4 mL media Tube 2 (100 cells/well): 10,000 cells in 20 mL media Tube 3 (10 cells/well): 2,000 cells in 40 mL media Tube 4 (1 cell/well): 300 cells in 60 mL media
20
2.2 结直肠癌干细胞培养
实验步骤（Procedure）：基本同BCSCs
1. 配置结直肠癌干细胞培养基（CRCSCs culture medium）；
Total volume: 50 mL
(1) DMEM/F-12; (2) B27;
(3) EGF;
(4) bFGF;
2. 检测CSC相关因子：
培养所需材料：超低粘附细胞培养板或培养瓶
6孔超低黏附（吸附）培养板 （美国Corning公司）
T25超低黏附培养瓶 （美国Corning公司）
14
2.1 乳腺癌干细胞培养
培养所需材料：细胞培养基、细胞因子及其他添加材料（PMID: 29405062）
DMEM/F12基础培养基 （HyClone）
EGF （Prospec）
PMID: 22387005
PMID: 22824809
PMID: 17122772 PMID: 17122771
8
1.4 肿瘤干细胞标志物
Tumor type
Melanoma Pancreas adenocarcinoma
Renal carcinoma
Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC)
lls culture technology）
陈超 外泌体课题组
1
主要内容
u1 肿瘤干细胞简介 u2 肿瘤干细胞培养技术 • 2.1 乳腺癌干细胞培养 • 2.2 结直肠癌干细胞培养
2
1. 肿瘤干细胞简介
3
1.1 肿瘤干细胞起源
最初形成肿瘤不一定是肿瘤干细胞（Cancer stem cells, CSCs），尽管肿瘤 起始细胞（Cancer-initiating cells）与CSCs有时能够互换1。
Hepatocellular carcinoma
Colon cancer
Cell surface marker
CD34+, CD38EPCAM(ESA)+, CD44+, CD24-,
ALDH, CD29, CD133 CD133+, CD44+, CD117+, CD24+
CD133+, CD15+ CD133+, CD15+
22
2.2 结直肠癌干细胞培养
-In vitro CRC LDA
Cell seeding for an in vitro limiting dilution assay
Cell concentration (#cells/well) Number of 96 well plates Number of wells
PMID: 18539956
PMID: 19805294 PMID: 16449977
9
2. 肿瘤干细胞培养技术
10
2 肿瘤干细胞培养技术
实验室经典的细胞分选方法为FACS。side-population技术是指用Hoescht 33342 或Rhodamine 123染色细胞，CSCs的耐药能力是其能够排除两种燃料中的任何 一种。然而这并不是最佳的方案（耗时长，技术含量高，获取分选细胞少）。
12
2 肿瘤干细胞培养技术
分选后进行细胞培养：微球培养技术。
-传统的细胞培养，在高血清细胞培养 基中，细胞生长在培养瓶底部； -微球培养中，细胞处于无血清培养基 及超低黏附培养瓶中，在这种条件下 ，分化的细胞将会死亡，但是CSCs 会存活以及增殖形成漂浮的细胞球。
13
2.1 乳腺癌干细胞培养
CSCs培养模式：分选-培养（以breast CSCs培养为例）
CD45−, CD90+
CD133+, CD44+, CD26+, ALDH
References
PMID: 21318290 PMID: 19858069 PMID: 16449977 PMID: 12629218 PMID: 18775674 PMID: 15549107 PMID: 18567795
1,000
0.25
24
100
1
96
1
2
192
-彻底的混匀细胞悬液，根据上表在96孔细胞培养板中加入细胞悬液（200μL/well）； -利用显微镜观察，标记出含有单个细胞的培养板孔； -2~4周后，观察形成肿瘤球的培养板孔； -计算CSC形成肿瘤球的频率 （Analysis software: .au/software/elda/）
23
-In vivo CRC LDA
2.2 结直肠癌干细胞培养
Serially dilute cells so that you have the following final cell concentrations Tube 1 (50,000 cells/injection): 600,000 cells in 360 μL media Tube 2 (10,000 cells/injection): 120,000 cells in 360 μL media Tube 3 (1,000 cells/injection): 12,000 cells in 360 μL media Tube 4 (100 cells/injection): 1200 cells in 360 μL media Tube 5 (10 cells/injection): 120 cells in 360 μL media
16
2.1 乳腺癌干细胞培养
实验步骤（Procedure）：
3. 对细胞进行拍照，一般0d, 2d, 4d, 6d或0d, 1d, 3d, 5d, 7d进行拍照；
MDA-MB-231 CSCs
MDA-MB-231
4T1 CSCs
前期长势慢，后期快，一般一周左右传代一次，中途需添加CSCs培养基。
17
5
1.2 肿瘤干细胞特征
3. CSCs对治疗耐受8。
CSCs耐受的主要机制包括： 1）药物外排（ABC-transporters） 2）抗凋亡通路 3）干扰细胞分化 4）乙醛脱氢酶（ALDH） 5）缺氧环境 6）DNA损伤反应 7）周期静止 8）促生存信号通路
Ref: 8Drug Discov Today, PMID: 24819719
bFGF （Prospec）
P/S （gbico）
B27 （gibco）
Insulin （Genview）
BSA （sigma）
氢化可的松注射液 （天津金耀）
15
2.1 乳腺癌干细胞培养
实验步骤（Procedure）：
1. 配置乳腺癌干细胞培养基（BCSCs culture media）；
Total volume: 50 mL
Cancer stem cells 19
2.1 乳腺癌干细胞培养
实验步骤（Procedure）：
-检测CSC自我更新能力（PMID: 28214331）
-检测CSC上皮间充质转化（EMT）相 关指标：E-cadherin/snail and Ncadherin/Vimentin，检测得比较少，可 不检测（PMID: 30188754）
2. CSCs具有一些干细胞特征，包括：休眠、DNA修复机制激活、药物转运蛋白 （ABC）表达以及对细胞凋亡天然抗性7。
Refs: 4Histopathology, PMID: 19723143; 5Nat Cell Biol, PMID: 20418870; 6Cell, PMID: 18485877; 7Cancer Res, PMID: 14583474
2.1 乳腺癌干细胞培养
实验步骤（Procedure）：
4. 裸鼠移植瘤实验检测 CSCs成瘤能力（对比普通 肿瘤细胞和CSCs）；
接种细胞密度不一致： CSCs可比普通肿瘤细胞接 种密度低2~3个数量级，呈 梯度增加。
Attentions: -建议体内成瘤实验之前先流式细胞术检测所培养肿瘤干细胞中肿瘤干细胞标志物，如乳 腺癌干细胞标志物CD44+、CD24-等，既能说明培养方式未使肿瘤干细胞分化或分化较少 ，又能保证移植瘤实验的成功率； -裸鼠移植瘤实验皮下成瘤即可，原位移植瘤更好； -既要关注移植瘤成瘤率，还要关注移植瘤成瘤时间。
LUNG
Prostate cancer
Cell surface marker
CD20+, CD271+ CD44+, CD24+
CD133+
CD44+, ALDH1
CD133+, CD90, CD117, ALDH1 CD44+, CD133+, CD49
References
PMID: 16230395 PMID: 17122772 PMID: 17122772
6
1.3 肿瘤干细胞分离
FACS（荧光激活细胞分选术）和MACS（磁珠细胞分选）是分选CSCs的主 要技术。
FACS：通过细胞水平特殊蛋白表达、细胞培养、表观遗传学变化以及CD24 、CD133、CD44等细胞水平标志物的表达方式来分离细胞。
MACS：干细胞分离标准方法，根据特殊干细胞标志物（如CD133）的表达 分离细胞。
CSCs的存在最早是在40年前被提出来的，支持CSCs存在的最佳证据来源于 对恶性血液性疾病的研究2,3。TPC (Tumor Propagating Cell) = CSCs。
Refs: 1Stem Cell Discovery, 2014, 4, 83-89; 2Nature, PMID: 7509044;
(1) DMEM/F-12; (2) B27;
(3) EGF;
(4) bFGF;
(5) BSA;
(6) Insulin;
(7) Hy;
(8) P/S.
2. 胰蛋白酶消化已分选肿瘤细胞，接种于超低黏附培养板；
梯度稀释：
接种于超低黏附6孔培养板， 1000~20000 cells/4 mL, 以确定 后期需要传代的密度及生长周 期。
18
2.1 乳腺癌干细胞培养
实验步骤（Procedure）：
5. 体外检测CSC相关因子及干细胞标志物等； -检测CSC生物标志物：CD44/CD24/ALDH（PMID: 28376210）
-检测CSC干性相关因子：Nanog, Cancer cells Oct-4, Sox-2, and C-myc（PMID: 30188754）
3Methods Cell Biol, PMID: 18442654.
4
1.2 肿瘤干细胞特征
1. CSCs的迁移对转移的影响。CD133+胰腺癌细胞具有形成肿瘤的能力；这些 细胞能够连续传代，说明其具有自我更新能力，且能够通过制造分化的、非致瘤 的子代产生肿瘤异质性4。 EMT（上皮间充质转化）-信号通路相关（如Wnt信号通路5）；经历EMT过程的 肿瘤细胞呈现CSC特性6。
流式细胞仪
免疫磁珠分选装置
7
1.4 肿瘤干细胞标志物
Tumor type
Acute myeloid leukemia (AML)
Breast cancer
Ovarian cancer
Glioblastoma
Medulloblastoma Small cell and nonesmall cell lung cancer
11
2 肿瘤干细胞培养技术
另外一种细胞分选方法为MACS，操作简便，但是一次只能够分选一个标志物。
1. 特异性免疫磁珠标签于肿瘤 细胞：带CSC标志物的细胞将 会被带有标签； 2. 用磁珠分选装置分选细胞： 将带有磁珠的细胞吸附于分选 装置上，其余细胞将被洗脱； 3. 将靶标细胞从分选装置上洗 脱。
CD133, CD44, and et al.（PMID: 21948564）
21
2.2 结直肠癌干细胞培养
3. Extreme Limiting Dilution Analysis（ELDA, 极限稀释法）检测CSC干性特征； -In vitro CRC LDA
Serially dilute cells to obtain the following final cell concentrations Tube 1 (1,000 cells/well): 27,000 cells in 5.4 mL media Tube 2 (100 cells/well): 10,000 cells in 20 mL media Tube 3 (10 cells/well): 2,000 cells in 40 mL media Tube 4 (1 cell/well): 300 cells in 60 mL media
20
2.2 结直肠癌干细胞培养
实验步骤（Procedure）：基本同BCSCs
1. 配置结直肠癌干细胞培养基（CRCSCs culture medium）；
Total volume: 50 mL
(1) DMEM/F-12; (2) B27;
(3) EGF;
(4) bFGF;
2. 检测CSC相关因子：
培养所需材料：超低粘附细胞培养板或培养瓶
6孔超低黏附（吸附）培养板 （美国Corning公司）
T25超低黏附培养瓶 （美国Corning公司）
14
2.1 乳腺癌干细胞培养
培养所需材料：细胞培养基、细胞因子及其他添加材料（PMID: 29405062）
DMEM/F12基础培养基 （HyClone）
EGF （Prospec）
PMID: 22387005
PMID: 22824809
PMID: 17122772 PMID: 17122771
8
1.4 肿瘤干细胞标志物
Tumor type
Melanoma Pancreas adenocarcinoma
Renal carcinoma
Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC)
lls culture technology）
陈超 外泌体课题组
1
主要内容
u1 肿瘤干细胞简介 u2 肿瘤干细胞培养技术 • 2.1 乳腺癌干细胞培养 • 2.2 结直肠癌干细胞培养
2
1. 肿瘤干细胞简介
3
1.1 肿瘤干细胞起源
最初形成肿瘤不一定是肿瘤干细胞（Cancer stem cells, CSCs），尽管肿瘤 起始细胞（Cancer-initiating cells）与CSCs有时能够互换1。
Hepatocellular carcinoma
Colon cancer
Cell surface marker
CD34+, CD38EPCAM(ESA)+, CD44+, CD24-,
ALDH, CD29, CD133 CD133+, CD44+, CD117+, CD24+
CD133+, CD15+ CD133+, CD15+
22
2.2 结直肠癌干细胞培养
-In vitro CRC LDA
Cell seeding for an in vitro limiting dilution assay
Cell concentration (#cells/well) Number of 96 well plates Number of wells
PMID: 18539956
PMID: 19805294 PMID: 16449977
9
2. 肿瘤干细胞培养技术
10
2 肿瘤干细胞培养技术
实验室经典的细胞分选方法为FACS。side-population技术是指用Hoescht 33342 或Rhodamine 123染色细胞，CSCs的耐药能力是其能够排除两种燃料中的任何 一种。然而这并不是最佳的方案（耗时长，技术含量高，获取分选细胞少）。
12
2 肿瘤干细胞培养技术
分选后进行细胞培养：微球培养技术。
-传统的细胞培养，在高血清细胞培养 基中，细胞生长在培养瓶底部； -微球培养中，细胞处于无血清培养基 及超低黏附培养瓶中，在这种条件下 ，分化的细胞将会死亡，但是CSCs 会存活以及增殖形成漂浮的细胞球。
13
2.1 乳腺癌干细胞培养
CSCs培养模式：分选-培养（以breast CSCs培养为例）