免疫标记技术

常用的酶及其底物 酶 辣根过 氧化物 酶 (HRP) 底物
邻苯二胺 (OPD) 四甲替联苯胺 (TMB) 5氨基水杨酸 (5AS) 邻联苯甲胺 (OT) 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻 唑啉磺酸-6)铵盐 (ABTS )
显色反应 测定波长
橙红色 蓝绿色 棕色 蓝绿色
蓝绿色
492 450 449 425 642
酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可导致大 量的催化过程，所以极为敏感。它的催化过程 有两种基本形式： (1)E十S →(ES)→E十P (2)E十S →＝(ES) (ES)十D1 →E十P十D2 E为酶，S为酶作用的底物，P为底物分解 后的产物，D，为供氢体，D：为D1的氧化型。 如P或D：为有色化合物，即可用呈色反应显示 酶的存在。
HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2) 和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型 染料，通过反应可生成有色的氧化型染料 (D)。酶促反应的过程如下: HRP DH2＋H2O2────→D＋2H2O
供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如 DAB(3.3－二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉 淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或 电镜观察。5AS(5-氨基水杨酸)早期曾用于ELISA， 但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色， 现已很少应用。OT(邻联甲苯胺)的特点是能产生 鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应中受温 度影响较大，而且由于产物不稳定，需要在短时 间内进行测定。
荧光是指一个分子或原子吸收了给 予的能量后，即刻引起发光；停 止能量供给，发光亦瞬即停止。 荧光素是一种能吸收激发光的光能 产生荧光，并能作为染料使用的 有机化合物。目前用于标记抗体 的荧光素主要有异硫氰酸荧光黄 (FITC)、四乙基罗丹明及四甲基 异硫氰酸罗丹明。
荧光效率 荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光，总或 多或少地以其他形式释放。荧光效率是指荧光分子将吸收 的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成 正比。 荧光效率＝发射荧光的光量分子数（荧光强度）／吸 收光的光量子数（激发光强度） 发射荧光的光量子数亦即荧光强度，除受激发光强度 影响外，也与激发光的波长有关。各个荧光分子有其特定 的吸收光谱和发射光谱（荧光光谱），即在某一特定波长 处有最大吸收峰和最大发射峰。选择激发光波长量接近于 荧光分子的最大吸收峰波长，且测定光波量接近于最大发 射光波峰时，得到的荧光强度也最大。
硝基酚半乳糖苷(ONPG)
黄色 405
420 深蓝
萤光
360 450 黄色 420
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)
比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。 HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶 蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。 HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为 PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多 在PH5左右。酶溶于水和58％以下饱和度硫酸铵溶液。 HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2 、小分子醇 的过氧化物和尿素过氧化物(urea peroxide)。H2O2应用最 多，但尿素过氧化物为固体，作为试剂较H2O2方便、稳定。 试剂盒供应尿素过氧化物片剂，用蒸馏水溶解后，在底物 缓冲液中密闭、低温（2～8℃）可稳定1年。
免疫印迹化学发光试剂（ECL Reagent）
基本原理: 辣根过氧化酶使试剂中的发光物（Luminol）氧化 并发光，而试剂中含有增强剂这使得发光增强了 1000倍。在免疫印迹中，将复杂的蛋白混合物经 SDS-PAGE分离，并转移到固相膜上（如NC、 PVDF）等，用于免疫学检测，经HRP标记的抗 体与膜上的蛋白直接（标记一抗）或间接（标记 二抗）反应。当加入免疫印迹化学发光试剂后， Luminol发生氧化降解，形成的不稳定中间产物由 激发态衰减到基态并发射光线，这种波长428 nm 蓝色可见光通过X线胶片接收，使该部位的胶片 曝光而指示出特异性产物的存在。
胶 体 金 标 记 技 术
生物素与亲合素标记技术
生物素-亲合素系统 (biotin-avidin system，BAS)， 是70年代后期应用于免疫学，并得到迅速发展的 一种新型生物反应放大系统。由于它具有生物素 与亲合素之间高度亲和力及多级放大效应，并与 荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合， 使各种示踪免疫分析的特异性和灵敏度进一步提 高。BAS已经广泛应用于生物医学实验研究的各 个领域，既可用于微量抗原、抗体及受体的定量、 定性检测及定位观察研究，亦可制成亲和介质用 于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化。
3.3－二氨基联苯胺 (DAB) 棕色不溶 性沉淀
4-硝基酚磷酸盐(PNP)
黄色
黑紫色 沉淀
405
碱性磷酸酯 BCIP/NBT 酶 (AP)
萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐
红色
500
葡萄糖氧化 ABTS+HRP+葡萄糖 酶 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰
β-Ｄ－半乳 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG) 糖苷酶
B.间接法：用荧光素标记二抗。检测过程分为两 步：第一次，将待测一抗加在含有已知抗原的 标本片上作用一定时间，洗去未结合的抗体。 第二，滴加标记二抗。如果第一步中的抗原抗 体已发生结合，此时加入的标记二抗就和已固 定在抗原上的一抗结合，形成抗原-抗体-标记 抗抗体复合物，并显示特异荧光。此法的优点 是敏感性高于直接法，且无需制备每一种荧光 素标记的特异抗体，就可用于检测同种动物的 多种抗原抗体系统。间接法的缺点是有时易产 生非特异性荧光。
直接免疫荧光法原理示意图
间接免疫荧光法原理示意图
放射免疫标记技术
基本原理： 放射免疫标记技术是将同 位素分析的高灵敏度与抗 原抗体反应的特异性相结 合，以放射性同位素作为 示踪物的标记免疫测定方 法。
由于放射免疫标记技术具有灵敏度高(可检测出毫微 克(ng)至微微克(pg)，甚至毫微微克(fg)的超微量物 质，特异性强(可分辨结构类似的抗原)、重复性强、 样品及试剂用量少测定方法易规范化和自动化等多 个优点。因此、在医学及其他生物学科的研究领域 和临床实验诊断中广泛应用于各种微量蛋白质、激 素、小分子药物及肿瘤标志物等的分析与定量测定。 缺点是试剂使用期限短，存在放射性污染 。目前常 用的同位素是125I
A.放射免疫测定(Radio immunoassay，RIA) 标记抗原和未标记抗原对有限量抗体的竞 争性结合或竞争性抑制反应。 B.免疫放射测定 (IRMA)待测抗原与过量标记 抗体的非竞争综合反应。 C.放射受体分析(RRA)与免疫放射测定相似。 应用放射性同位素标记配体，在一定条件 下与相应受体结合成配体-受体复合物。
HRP标记抗体的方法
A.戊二醛法
B.过碘酸盐氧化法
胶体金标记技术
胶体金标记技术 (Immunogold labeling technique) 是以胶 体金作为示踪标记物，应用于抗原抗体反应的一种新型免 疫标记技术；胶体金是由氯金酸在还原剂如白磷、抗坏血 酸、枸橼酸钠和鞣酸等作用下，聚合成特定大小的金颗粒， 并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，故称为胶体金。 利用它在碱性环境中带负电荷的性质，与蛋白质分子的正 电荷基团藉静电吸引而形成牢固结合，除抗体蛋白外，胶 体金还可与其他多种生物大分子结合。根据胶体金的一些 物理特性，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应， 加上结合物所具有的免疫-生物学特性，使其在免疫学、 组织学、病理学及细胞生物学标记研究工作中得到广泛应 用。
荧光抗体染色方法 ：
A.直接法：这是荧光抗体技术最简单和基本的方 法。滴加荧光抗体于待检标本片上，经反应和 洗涤后在荧光显微镜下观察。标本中如有相应 抗原存在，即与荧光抗体特异结合，在镜下可 见有荧光的抗原抗体复合物。此法的优点是简 单、特异。但其缺点是检查每种抗原均需制备 相应的特异性荧光抗体，且敏感性低于间接法
B.生物发光是指发生在生物体内的发光现象， 如荧火虫的发光。以往化学发光和生物发光 看作是彼此独立的过程，随着这一领域研究 的深人，逐渐加深了对各种生物发光反应机 理的认识。实际上，生物体内的各种发光现 象都与化学反应有关，实际上生物发光是发 生在生物体内的一种化学发光。
发光免疫分析的类型
化学发光免疫分析:以化学发光物质标记抗原或抗体， 免疫反应后，直接引发化学发光反应进行检测。 化学发光酶免疫分析:用参与某些发光反应的酶来标 记抗原或抗体。免疫反应后，加入发光试剂，测 定发光体系的发光强度进行抗原或抗体测定。 生物发光免疫分析:利用生物发光物质或参与生物发 光反应的辅助因子标记抗原或抗体。免疫反应后， 运用生物发光反应进行检测。
常用的几种免疫标记技术
免疫荧光标记技术 放射免疫标记技术 酶标记技术 胶体金标记技术 生物素和亲和素标记技术 发光免疫标记技术
免疫荧光标记技术
基本原理： 免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感 性与显微示踪的精确性相结合。以荧光素作为标 记物，与已知的抗体(或抗原)结合、但不影响其 免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准 试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。在荧光显微 镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复 合物及其存在部位。在实际工作中，由于用荧光 素标记抗体检查抗原的方法较为常用，所以一般 通称为荧光抗体技术。
酶免疫标记技术
免疫酶技术就是将抗原和抗体的免疫反应和酶的 催化反应相结合而建立的一种新技术。酶与抗体 或抗原结合后，既不改变抗体成抗原的免疫学反 应的特异性，也不影响酶本身的酶学活性，即在 相应而合适的作用底物参与下，使基质水解而呈 色，或使供氢体由无色的还原型变为有色的氧化 型。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜和电子 显微镜观察，也可以用分光光度计加以测定。这 是一种特异而敏感的技术，可以在细胞或亚细胞 水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、 甚至纳克水平上对其进行定量。
目前用得较广泛和较满意的供氢体是：OPD(邻苯 二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为 橙红色，后者产物为蓝绿色，二者的可溶性均好， 在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上 据报道后者比前者可高4倍以上。另外，还有一种 供氢体称ABTS[2, 2‘-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡 咯啉-6磺酸)]，其反应产物呈蓝绿色，且灵敏度和 稳定性均好，ABTS虽不如OPD和TMB敏感，但 空白值极低。尤其是在致癌的潜在可能性方面， ABTS与TMB皆是值得被优选的供氢体。
发光免疫标记技术
发光免疫分析是将 发光分析和免疫反 应相结合而建立的 一种新型超微量分 析技术。这种方法 兼具有发光分析的 高灵敏性和抗原抗 体反应的高度特异 性。
A.化学发光是指伴随化学反应过程所产生的光 的发射现象。某些物质在进行化学反应时， 吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应 产物分子激发到电子激发态。当电子从激发 态的最低振功能级回到基态的各个振动能级 时产生辐射，多余的能量以光子的形式释放 出来，这一现象称为化学发光。
BAS
BAS用于检测的基本方法
A.标记亲和素连接生物化大分子反应体系，称 BA法 B.以亲和素两端分别连接生物素化大分子反应 体系和标记生物素，称为BAB法 C.将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素-生物 素-过氧化物酶复合物，再与生物素化的抗抗 体接触时，将抗原-抗体反应体系与ABC标记 体系连成一体，称为ABC法。
免疫标记技术
免疫标记技术
免疫标记技术指用荧光素、放射性同位素、 酶、铁蛋白、胶体金及化学(或生物)发光剂 等作为追踪物，标记抗体或抗原进行的抗原 抗体反应；并藉助于荧光显微镜，射线测量 仪，酶标检测仪，电子显微镜和发光免疫测 定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察 或进行自动化测定。
免疫标记技术可以在细胞、亚细胞、超微 结构及分子水平上，对抗原抗体反应进行 定性和定位研究；或应用各种液相和固相 免疫分析方法，对体液中的半抗原、抗原 或抗体进行定性和定量测定。因此，免疫 标记技术在敏感性、特异性、精确性及应 用范围等方面远远超过一般免疫血清学方 法。
亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，分 子量为68kDa，由4个亚单位组成，对生物素有 非常高的亲和力(结合常数高达1015M-1)。生物 素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合。这样， 结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生 物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又 由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达 到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。