液体活检ppt课件
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—— “三驾马车”：CTC、ctDNA 和外泌体
液态活检通过非侵入性的取样方式获得肿瘤信息，辅助癌症治疗，是“精准医 疗”代表性的诊断技术。作为传统活检的替代技术，以及癌症早期筛查的新技 术，液体活检正进入发展的黄金时期，
-
4
分子医学时代的入口 CTC、ctDNA 和外泌体的差异
超用复 早药发 预指监 警导控
非主流，技术独创性强，代表公司如贝瑞和康、安可济等 主要特点：DNA分子单链成环，RCA扩增或多重PCR扩增建库，成本低，不需要合成探针芯片，随时可以增加 位点，对靠近断裂点的突变位点有较好的检查率，单背靠背扩增受一次引物对数量制约（通量受限）
• 高度碎片化 碎片大小范围分布在从30b-250bp，多数在140bp-160bp。
• 含量少且变化大 cfDNA中多数野生背景，不同ctDNA片段的含量从0.01%到10%；
• 超早期、高肿瘤特异性，但缺少组织和器官特异性
-
8
ctDNA的研究进展和临床应用 ctDNA的临床应用
无创、全面、实时、来自百度文库捷
精准医疗：Precision Medicine Initiative ࣁ
在恰当的时候给患者以精准的治疗 Delivers the right treatment at the right time
对癌症的认识：从“组织（细胞）鉴别”向“分子诊断”的历史3转变！
-
分子医学时代的入口 液体活检，分子医学的入口
-
9
ctDNA的研究进展和临床应用 ctDNA指导用药
CAPP-Seq NGS用于血浆ALK&ROS1融合检测
1. 8例患者在血浆中均检测出ALK或ROS1 融合
2. 接受克唑替尼治疗后，肿瘤缩小
-- AM. Newman,et al.Nat Med 2014
-
10
ctDNA的研究进展和临床应用 ctDNA预后评估
2. 多重PCR扩增过程会引入一定比例的“假突变”。 3. DNA上遗传SNP的干扰。
漏检问题：需要补救技术
1. 技术本身问题。如ctDNA加接头，有效性仅10-15%，丢失80-90%
片段信息；
2. 超低频ctDNA在PCR扩增中淹没，也就是偏向扩增导致低频ctDNA
-
15
ctDNA临床应用瓶颈
扰因素多
• 稳定，含量较高，内容
物多样性，受干扰因素
少
• CTC
• 检测相对简单
药转预 物移后 选分评 择析估
• 中晚期癌症指标，目前主要用于预后 • 新的研究结果显示在早期癌症患者外周血中也能检测到CTC • 正在向活细胞捕获发展，用于后期分子分型，及药物选择 • 稳定但含量较少，分离鉴定难度大，依赖于新的技术进步
ctDNA靶向测序建库方法
➢ Ion Ampli-seq
ABI公司独有技术，通过多重PCR靶向扩增目的片段，能够以FFPE gDNA和血浆cfDNA为模板进行建库 主要特点：能够特异性扩增目的片段，但受限于扩增体系引物间的互相干扰，靶位点数会受到限制，位点过 多可能需要分多个引物pool，且扩增产物存在引物二聚体需要纯化去除。
-
5
分子医学时代的入口
CTC、ctDNA 和外泌体在肿瘤各阶段的应用
ctDNA Panel 外泌体/血小板RNA panel （早筛预警及现实风险评估）
血浆甲基化标志物
血清蛋白标志物
血清外泌体miRNA标志物 血清/尿液外泌体蛋白
尿液外泌体RNA标志物
标志物
（早癌诊断、鉴别及疗效判断）（中晚期诊断及疗效判断）
组织个体化用药标志物 ctDNA用药检测标志物
CTC预后评估
-
6
ctDNA的研究进展和临床应用 ctDNA的来源
-
7
ctDNA的研究进展和临床应用 ctDNA的特征
• 标志组合（panel） 每种肿瘤都有数百基因，数千位点的不同ctDNA，包含不同的突变。
• 不断演变及变化 每个人、每个肿瘤、不同阶段、不同时间、不同治疗，其突变基因、位点、种类及含量都在动态变 化。
-
1
分子医学时代的入口 ctDNA的研究进展和临床应用 CTC的研究进展和临床应用
-
2
分子医学时代的入口
分子医学时代的来临
• 2006年多国联合启动“国际癌症基因组计划”，已完成超过50种肿瘤 异常谱型，是“人类基因组计划”后又一重大科学研究。
• 2014年2月4日国际癌症基因组联盟(ICGC)公布超过1万个癌症基组的包 括致癌突变、甲基化和基因copy数变化等数据。
➢ 捕获建库+单分子标签
目前主流，技术相对成熟，>90%研究者采用该方案，代表公司如Guardant Health、Foundation、Roche、吉 因加、燃石等
主要特点：DNA探针或RNA探针杂交捕获，一次捕获多个目标区域，成本相对较高，无法随时增位点，无法检 测断裂点附近的突变位点
➢ 单链成环＋单分子标签
ctDNA和活体组织切片
-- J Clin Oncol.2014 Feb 20;32(6):579-86
2. 血液样本中的游离肿瘤DNA与活体肿瘤样本测序结果相匹配
-
12
ctDNA的研究进展和临床应用
-
13
ctDNA的研究进展和临床应用 ctDNA检测平台
荧光定量PCR
中通量 数十个点检测
灵敏度高
• ctDNA
• Exosomes
• 死细胞释放，杀伤性治疗 效果的实时监控指标
• 活细胞分泌，40-100nm， 1个活细胞状况实时监控
• ctDNA是一组Panel，癌 变标志物，没有组织特异 性和无癌症分期的区分
• 不稳定，含量较低，受干
疗鉴早 效别癌 监诊发 控断现
指标
• 母细胞来源标志物 （RNA／蛋白质），可 用于早期诊断
1. ctDNA有PI3KCA检出的乳腺癌患者，其预后要比没有
2. 检ct出DN的A患中者PI差3K。CA拷贝数高的乳腺癌患者，其预后要比拷 贝数低的患者差。
-- Breast Cancer Res Treat,2015,March
-
11
ctDNA的研究进展和临床应用 ctDNA动态监测
1. 分别采集肿瘤样本和血液样本，对比了同一时间点采集的
数字PCR
低通量 数个点检测 灵敏度最高
NGS测序
高通量 上万个点检测 应用前景广阔
-
14
ctDNA临床应用瓶颈 NGS在ctDNA上应用的难点
假阳性问题：需要纠错技术
1. NGS仪器本身问题：NGS是采用边合成边测序，合成过程掺入错误 千分之几，甚至百分之几，需要鉴别“真突变”而不是引入的 “假突变”。
液态活检通过非侵入性的取样方式获得肿瘤信息，辅助癌症治疗，是“精准医 疗”代表性的诊断技术。作为传统活检的替代技术，以及癌症早期筛查的新技 术，液体活检正进入发展的黄金时期，
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分子医学时代的入口 CTC、ctDNA 和外泌体的差异
超用复 早药发 预指监 警导控
非主流，技术独创性强，代表公司如贝瑞和康、安可济等 主要特点：DNA分子单链成环，RCA扩增或多重PCR扩增建库，成本低，不需要合成探针芯片，随时可以增加 位点，对靠近断裂点的突变位点有较好的检查率，单背靠背扩增受一次引物对数量制约（通量受限）
• 高度碎片化 碎片大小范围分布在从30b-250bp，多数在140bp-160bp。
• 含量少且变化大 cfDNA中多数野生背景，不同ctDNA片段的含量从0.01%到10%；
• 超早期、高肿瘤特异性，但缺少组织和器官特异性
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ctDNA的研究进展和临床应用 ctDNA的临床应用
无创、全面、实时、来自百度文库捷
精准医疗：Precision Medicine Initiative ࣁ
在恰当的时候给患者以精准的治疗 Delivers the right treatment at the right time
对癌症的认识：从“组织（细胞）鉴别”向“分子诊断”的历史3转变！
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分子医学时代的入口 液体活检，分子医学的入口
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ctDNA的研究进展和临床应用 ctDNA指导用药
CAPP-Seq NGS用于血浆ALK&ROS1融合检测
1. 8例患者在血浆中均检测出ALK或ROS1 融合
2. 接受克唑替尼治疗后，肿瘤缩小
-- AM. Newman,et al.Nat Med 2014
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ctDNA的研究进展和临床应用 ctDNA预后评估
2. 多重PCR扩增过程会引入一定比例的“假突变”。 3. DNA上遗传SNP的干扰。
漏检问题：需要补救技术
1. 技术本身问题。如ctDNA加接头，有效性仅10-15%，丢失80-90%
片段信息；
2. 超低频ctDNA在PCR扩增中淹没，也就是偏向扩增导致低频ctDNA
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ctDNA临床应用瓶颈
扰因素多
• 稳定，含量较高，内容
物多样性，受干扰因素
少
• CTC
• 检测相对简单
药转预 物移后 选分评 择析估
• 中晚期癌症指标，目前主要用于预后 • 新的研究结果显示在早期癌症患者外周血中也能检测到CTC • 正在向活细胞捕获发展，用于后期分子分型，及药物选择 • 稳定但含量较少，分离鉴定难度大，依赖于新的技术进步
ctDNA靶向测序建库方法
➢ Ion Ampli-seq
ABI公司独有技术，通过多重PCR靶向扩增目的片段，能够以FFPE gDNA和血浆cfDNA为模板进行建库 主要特点：能够特异性扩增目的片段，但受限于扩增体系引物间的互相干扰，靶位点数会受到限制，位点过 多可能需要分多个引物pool，且扩增产物存在引物二聚体需要纯化去除。
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分子医学时代的入口
CTC、ctDNA 和外泌体在肿瘤各阶段的应用
ctDNA Panel 外泌体/血小板RNA panel （早筛预警及现实风险评估）
血浆甲基化标志物
血清蛋白标志物
血清外泌体miRNA标志物 血清/尿液外泌体蛋白
尿液外泌体RNA标志物
标志物
（早癌诊断、鉴别及疗效判断）（中晚期诊断及疗效判断）
组织个体化用药标志物 ctDNA用药检测标志物
CTC预后评估
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ctDNA的研究进展和临床应用 ctDNA的来源
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ctDNA的研究进展和临床应用 ctDNA的特征
• 标志组合（panel） 每种肿瘤都有数百基因，数千位点的不同ctDNA，包含不同的突变。
• 不断演变及变化 每个人、每个肿瘤、不同阶段、不同时间、不同治疗，其突变基因、位点、种类及含量都在动态变 化。
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分子医学时代的入口 ctDNA的研究进展和临床应用 CTC的研究进展和临床应用
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分子医学时代的入口
分子医学时代的来临
• 2006年多国联合启动“国际癌症基因组计划”，已完成超过50种肿瘤 异常谱型，是“人类基因组计划”后又一重大科学研究。
• 2014年2月4日国际癌症基因组联盟(ICGC)公布超过1万个癌症基组的包 括致癌突变、甲基化和基因copy数变化等数据。
➢ 捕获建库+单分子标签
目前主流，技术相对成熟，>90%研究者采用该方案，代表公司如Guardant Health、Foundation、Roche、吉 因加、燃石等
主要特点：DNA探针或RNA探针杂交捕获，一次捕获多个目标区域，成本相对较高，无法随时增位点，无法检 测断裂点附近的突变位点
➢ 单链成环＋单分子标签
ctDNA和活体组织切片
-- J Clin Oncol.2014 Feb 20;32(6):579-86
2. 血液样本中的游离肿瘤DNA与活体肿瘤样本测序结果相匹配
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ctDNA的研究进展和临床应用
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ctDNA的研究进展和临床应用 ctDNA检测平台
荧光定量PCR
中通量 数十个点检测
灵敏度高
• ctDNA
• Exosomes
• 死细胞释放，杀伤性治疗 效果的实时监控指标
• 活细胞分泌，40-100nm， 1个活细胞状况实时监控
• ctDNA是一组Panel，癌 变标志物，没有组织特异 性和无癌症分期的区分
• 不稳定，含量较低，受干
疗鉴早 效别癌 监诊发 控断现
指标
• 母细胞来源标志物 （RNA／蛋白质），可 用于早期诊断
1. ctDNA有PI3KCA检出的乳腺癌患者，其预后要比没有
2. 检ct出DN的A患中者PI差3K。CA拷贝数高的乳腺癌患者，其预后要比拷 贝数低的患者差。
-- Breast Cancer Res Treat,2015,March
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11
ctDNA的研究进展和临床应用 ctDNA动态监测
1. 分别采集肿瘤样本和血液样本，对比了同一时间点采集的
数字PCR
低通量 数个点检测 灵敏度最高
NGS测序
高通量 上万个点检测 应用前景广阔
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14
ctDNA临床应用瓶颈 NGS在ctDNA上应用的难点
假阳性问题：需要纠错技术
1. NGS仪器本身问题：NGS是采用边合成边测序，合成过程掺入错误 千分之几，甚至百分之几，需要鉴别“真突变”而不是引入的 “假突变”。