血凝抑制实验

摘要：目前在禽流感血凝抑制试验方面存在很多问题，会对血凝抑制试验的意义造成影响从而导致不正确的结果；禽流感抗原也存在相的差异，在实
际检测中也容易出现误导。

关键词：血凝抑制相的差异标定
Problems in Hemagglutimation Inhibition Test with Avian Influenza
Liu Ping , Liu Dong , Li Bin , Wang QunYi ,Huan XiuRong,
Wang ZongSheng ，Fan GenCheng, Du YuanZhao
Qingdao YEBIO Bioengineering Co,National Animal Quarantine
Institute ,Ministry of Agriculture ,Qindao Shandong
Abstract: Quite a few problems exist with regard to hemagglutination test with avan influenza,affecting HI test meanings and leading to wrong results.Phase variation exists in avian influanza
antigen,causing mistakes in practical operation of HI test.
Keywords: Hemagglutination inhibition,phase variation,
standardization
禽流感病毒能够与鸡红细胞发生凝集现象，这种红细胞凝集现象可被特异性免疫血清所抑制，即红细胞凝集抑制实验（HI）。

由于血凝反应可被特异性抗体所抑制，抗体与病毒结合后，血凝素不能吸附于红细胞表面的受体上，因此血凝抑制试验可以用于：1）检测血清中的抗体水平。

2）鉴定病毒。

3）辅助诊断病毒性疾病。

4）作为适时免疫的辅助手段，能避免免疫失败、免疫空挡及重复免疫造成的损失。

目前在禽流感血凝抑制试验方面存在很多问题，会对血凝抑制试验的意义造成影响从而导致不正确的结果。

一、由于禽流感病毒变异较快，所以在血凝抑制试验中经常会出现不同厂家生产的相同亚型的禽流感抗原所测同一血清的血凝抑制价不同，禽流感亚型病毒株按其血凝抑制试验中所表现的亲和力不同而分为三种类型：对本株和异株免疫血清均呈较高效价的为“R”相；对本株效价高对异株低的为“P”相；对本株及异株均低的为“Q”相。

由此可见养殖户经常反映的打你们厂家的疫苗去别的地方检测结果往往会很低，这就是我们所说的“P”相，即抗原相的差异。

如果在试验中出现相的差异所测结果会相差2-3个滴度，所以在血凝抑制试验操作时，挑选亲和相毒株作为测定抗原较好，这样会提高诊断的灵敏度
(如下表)。

对禽流感毒株进行抗原分析时，必须采用交叉的血凝抑制试验，而不能采用单向的血凝抑制测定，以排除相别的影响。

同一血清用不同抗原检测的结果
二、禽类血清中往往含有非特异性血凝抑制因子，尤其是水禽血清在做禽流感血凝抑制试验时会出现对照孔和对照孔后2-3孔有凝集现象。

因此，在利用血凝抑制试验进行血清抗体测定之前，有必要对血清中非特异性因子进行排除。

热灭活是一种排除非特异性因子的有效方法，但对特异性抗体破坏较大。

利用受体裂解酶处理血清在美国禽流感诊断中已广泛应用。

但经过我们大量的临床试验发现水禽血清在经过受体裂解酶处理后有明显的差异，而鸡的血清却没有明显差异，所以在做血凝抑制试验时可对水禽血清用受体裂解酶进行处理，鸡血清不作处理结果影响不大。

三、在禽流感血凝抑制试验中抗原标定也是至关重要的一个环节。

首先在试验之前要对禽流感抗原用已知效价的标准阳性血清进行标定，以确定抗原的纯度。

抗原配制完后，需对所配制的抗原进行标定，看所配制的抗原是否达到所需标准，如工作抗原效价过高或过低对结果都有一定的影响。

过高，测定抗体效价偏低；过低，测定效价过高，甚至很高。

所以在禽流感血凝抑制试验中必须对抗原进行标定。

四、在进行试验操作时很容易出现错误，所以进行实验时一定要严格操作，每次测定应有严格的温度范围和作用时间，出现错误时要认真查找原因，以免类似错误再次出现。

另外，所用抗原应是稳定性好，效价高的浓缩抗原。

以下是容易出现的错误：
1.对照孔凝集
①盐类凝集：所谓盐类凝集即稀释液中氯化钠达至一定高浓度时，即使
没有血清抗体也能发生凝集反应。

②当生理盐水被细菌污染时也可出现对照孔凝集。

③血清变质或受细菌污染。

2.全部凝集
①当红细胞受细菌污染或保存时间过长可出现此现象。

②抗原滴加时出现失误，工作抗原效价过高。

①生理盐水受细菌污染或其它因素.
3、红细胞全部下滑
①当配制抗原时，配制工作抗原效价过低，不足以凝集鸡红细胞。

②加样时所有孔全部加成生理盐水亦出现全部下滑现象。

4、不同来源、不同浓度的红细胞会使结果差异很大，所以红细胞来源一定要相同：
一般需要3只或3只以上公鸡来提供红细胞，将3只以上公鸡红细胞混合在一起。

也可由1只公鸡来提供红细胞，但必须经临床多次使用证明是可行的。

有抗体鸡提供的红细胞需要更多次数洗涤。

但要注意有时不同的公鸡提供的红细胞对禽流感H5亚型抗体测定，效价差异很大。

不同浓度的红细胞对抗体测定也有影响。

5、温度对实验结果也有影响，一般要求在室温25-37℃进行实验，当实验温
度低于4℃时红细胞有时会发生自凝现象。

6、抗原与抗体作用时间过长或过短对结果影响较大：过短出现凝集不完全；
过长出现洗脱现象。

7、96孔V型板是否洗净，是否光滑也会影响实验结果。

总之在进行禽流感血凝抑制试验时应综合考虑各方面因素，制定一个标准化操作方法以免对结果判断产生误差，只有把试验标准化才能正确评价疫苗免疫存在的意义。

新技术员必看血凝抑制试验易出的问题
发布时间：2011-01-06
1标准阳性对照血清的抗体效价与原结果误差大于1个滴度
4个血凝单位(HAU)抗原配制不准确。

4个HAU抗原要现用现配，馄悬液要混匀，配好的抗原室温下放置不得超过4个小时，不可反复冻融。

为防止4个HAU抗原配制不准确．在作HI试验前必须做回归试验。

在微量反应板的1-4排的1-4孔内各加入50微升PBS液。

取已配好的4个HAU抗原混匀液50微升加入反应板的第1孔内混匀后吸取50微升加入第2孔，依次倍比稀释至第4孔，从第4孔内吸取50微升棍匀液弃掉．每孔内加入50微升l％红血球混悬液，震荡混匀，20-25度静置20分钟后观察结果。

若1孔、2孔红血球完全凝集，而3孔、4孔不凝集，则说明4个HAU配制准确，否则，需重新测定抗原效价，重新配制4个HAU抗原，并作回归试验，直至结果准确。

阳性对照血清效价降低。

阳性对照血清经反复冻融、长期保存或保存不当．会使抗体效价降低。

因此，阳性对照血清不可反复冻融，若要长期保存必须保存在-15度以下，不得超过保质期．冷藏保存不得超过4天。

2结果出现慢
在环境温度20—25度，经过15-30分钟即可读出抗原效价和血清抗体滴度。

当温度过低，如低于15度时，出现结果就要慢，往往需要超过40分钟才能出现清晰的结果。

因此，为了在较短的时间内出现结果，应将试验中的环境温度控制在20-25度。

3泪滴状流淌(完全血凝抑制)线细
一般是由于环境温度低，或是反应作用时间短，结果还没有完全显示。

需静置一段时间，读数。

4结果出现快，并且整板无凝集现象
试验过程中的环境温度超过30度时，试验结果出现的要快．往往在15分钟左右就可读数。

一旦时间过长，结果就会消失，使整板无凝集现象，给人一种误以为效价为O，或抗体滴度为12log2。

要求试验环境温度不得超过30度，反应15—30分钟及时读数，不可长时间拖延读数时间。

5整板无血细胞凝集现象
当试验环境在20-25度，经15—30分钟读数时，整板无红细胞凝集现象，有如下4种可能。

8份血清的抗体滴度为12log2；试验过程中全板少了加4个HAU抗原的步骤；4个HAU抗原已经失效；环境温度过高，读数时间拖延。

当整板无红细胞凝集现象时，要先查明原因。

可用微量移液器吸取每孔内的混悬液，当每孔内的馄悬液容量为50微升x3时，可能是前3种原因；每孔内的混悬液容量为50微升x2时，则是第2种原因。

无论哪种原因引起的全板无凝集现象，都须进行重新测。

由第3种原因引起的，要重新配制4个HAU抗原。

并注意操作过程中要专心，随时检查是否漏掉某些步骤，控制好试验过程中的环境温度，及时看结果。

6 8份被检样品结果全为Iog2
当8份被检样品全是第1孔完全血凝抑制，而2-12孔无凝集。

用移液器吸取第1孔内容量为50微升x4，而2—12孔容量为50微升x 3。

此种情况一般发生在8道微量移液器操作时，遗漏了将被捡样品逐孔倍比稀释，使第1孔内抗体含量高，完全抑制了抗原凝集红细胞的能力，而出现完全血凝抑制；2-12孔内引无抗体，只有抗原，导致2-12孔全部红细胞凝集。

也可能是8份被检血清的抗体滴度全为1log2，但此种情况极少出现。

因此，要分析原因，进行复检。

加入1％红细胞的混悬液始终为暗红色，既无红细胞凝集现象，也无血凝抑制现象，一般是1％红细胞混悬液溶血。

要求采血、配制1%红细胞时，尽量减少细菌污染。

采集血液时要尽量采集至少3只SPF公鸡或无禽流感、新城疫等抗体的健康公鸡血与等量阿氏液(葡萄糖2．05克、柠檬酸钠0．8克、柠檬酸0．055克、氯化钠0．42克，加纯化水至100毫升，散热溶解后调pH值至6．1，69千帕15分钟高压灭菌，4度保存备用)混合，或按1／10比例加入灭菌的3．8％—4．O％的柠檬酸酸钠混匀以防血液凝固。

用灭菌的生理盐水或pH值7．2、0．01摩尔／升的PBS液洗3次。

若要长时间保存，可将洗涤好的盛有虹细胞的试管内加人多量无菌阿氏液压底，4度保存，至少可保存1星期。

浅谈血凝抑制试验中存在的问题及解决方法
某些病毒(如新城疫、禽流感病毒等)具有凝集某种动物红细胞的现象，这种现象可被特异性免疫血清所抑制，即为红细胞的血凝抑制。

血凝抑制试验可用于测定免疫抗体效价、辅助诊断病毒性疾病等方面。

在基层工作中微量血凝抑制试验 (HI)最常用于新城疫、禽流感等免疫抗体的检测。

尽管此法操作简便、快速、准确、实用，但在实践中也常常由于某些因素的影响，从而使试验结果不精确，有时甚至无法判定结果。

下面把本人在实验中遇到的问题及采取的解决方法总结如下，希望与大家共同探讨。

1.被检血清腐败变性
被检血清腐败变性严重影响免疫抗体检测。

因此，血样采集后要及时分离血清，分离后及时测定或放置在4℃冰箱内保存，要力求新鲜，如暂时不测定可冷冻保存。

血清使用前要充分摇匀。

2.不同来源的红细胞对试验结果也有很大影响
由于不同个体鸡只红细胞对病毒的敏感性不同从而影响HI效价，所以一般需要采取3只以上公鸡红细胞混合一起用，最好用非免疫公鸡，如果用免疫公鸡代替，须增加洗涤次数和时间。

3.病毒悬液和红细胞悬液在使用前没有摇匀
病毒悬液和红细胞悬液如没有摇匀，加入时浓度高低不一，会人为造成误差。

因此抗原和红细胞使用前一定要摇匀，保证每一孔中加入的浓度准确一致。

4.4个血凝单位(HAU)抗原配制不准确
4个HAU抗原要现用现配，混悬液要混匀，配好的抗原室温下放置不得超过4个小时，不可反复冻融。

为防止4个HAU抗原配制不准确.在作HI试验前必须做4单位抗原校正。

用微量移液器向反应板的第二孔至第五孔加生理盐水25微升，第一孔不加。

用微量移液器吸取4单位抗原25微升分别加入第一孔、第二孔中，从第二孔开始挤压4-6次混合，然后吸出25微升至第3孔，依次倍比稀释到第4孔，弃去25微升。

用微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入1-5孔，每孔25微升。

于微量振荡器上振荡1分钟。

室温静置20-30分钟后观察结果。

若第一、二、三孔为完全凝集，第四孔红细胞为50%沉淀，第五孔为对照完全沉淀，如果出现以上结果，表明所配4单位抗原准确，校正成立。

否则，需重新测定抗原效价，重新配制4个HAU 抗原，并作4单位抗原校正，直至结果准确。

5. 适量配制4单位抗原和1﹪红细胞
配制好的4单位抗原在2-8度保存条件下，3天内效价基本无变化，1﹪红细胞在2-8度保存条件下，3天内不会发生溶血。

超过3天，4单位抗原和1﹪红细胞会因自身效价降低和溶血而影响实验结果。

因此，每次实验前要根据待测样品数量计算一下本次实验需要多少的4单位抗原和1﹪红细胞，适当配置，避免因多配而引起浪费。

6.结果出现慢
在环境温度20～25℃，经过20～30分钟即可读出抗原效价和血清抗体滴度。

当温度过低，如低于15℃时，出现结果就要慢，往往需要超过40分钟才能出现清晰的结果。

因此，为了在较短的时间内出现结果，应将试验中的环境温度控制在20～25℃，冬、春季可放入相应温度的恒温培养箱进行反应。

7.结果出现快，并且整板无凝集现象
试验过程中的环境温度超过30℃时，试验结果出现的要快。

往往在15分钟左右就可读数。

一旦时间过长，结果就会消失，使整板无凝集现象，给人一种误以为效价为O，或抗体滴度为12log2。

故要求试验环境温度不得超过30℃，反应20-30分钟及时读数，不可长时间拖延读数时间。

8.泪滴状流淌(完全血凝抑制)线细
一般是由于环境温度低，或是反应作用时间短，结果还没有完全显示。

需静置一段时间后再读数。

此时，亦可用恒温培养箱来控制温度和时间以保证实验的正常进行。

9.微量血凝板的清洗，对试验结果有很大的影响
目前，实验单位和基层多使用一次性96孔V型板，使用后不用清洗。

若使用玻璃材料的96孔凝集板，使用后要按程序清洗干净：试验完毕即将凝集板用自来水反复冲洗，再用含洗涤剂的温水溶液浸泡30分钟，并在洗涤剂溶液中以棉拭子刷洗凹孔及板面，待反应板干燥后，放到2～3%浓度的盐酸中浸泡24小时以上，捞出用自来水冲洗多次，最后以蒸馏水冲洗2～3次，在37度温箱中烘干备用。

总之，在进行微量血凝抑制试验中，一定要细致耐心，操作程序要规范，同时综合考虑各方面的因素，发现问题及时纠正处理，这样才会获得满意的实验结果以正确评价疫苗免疫的效果及辅助诊断病毒性疾病。

血凝抑制试验为何用4个血凝单位
4个单位以下，病毒过少，红细胞剩余，成团，可误以为是抗体中和病毒导致，出现假阳性。

4个单位以上，病毒过多，凝集后有病毒剩余，若血清中有抗体，恰好中和了剩余的病毒，出现完全凝集，假阴性。