畜禽肉蛋及水产中4种氟喹诺酮类药物残留的快速测定_张鑫

药物名称 环丙沙星
药物名称 环丙沙星 达氟沙星 恩诺沙星 沙拉沙星
鸡蛋中添加四种氟喹诺酮类药物回收率 添加浓度 w / （ ng / g） 平均回收率 / % 10 ， 20 10 ， 20 10 ， 20 2， 4 83. 6 ， 86. 5 92. 7 ， 92. 2 87. 9 ， 90. 2 88. 3 ， 89. 6
第 28 卷增刊 2009 年 12 月
分析试验室 Chinese Journal of Analysis Laboratory
Vol. 28. Suppl. 2009 － 12

畜禽肉蛋及水产中 4 种氟喹诺酮类药物残留的快速测定
［14 ］ 和 7. 2 ～ 8. 9 ，文献 中可选用的提取液总类较 多，大体分为酸性水溶液、水不溶非极性有机溶
图5
流动相 pH 值对荧光响应强度的影响
2. 6
定量限
本方法的定量限为 10 ng / g（ 达氟沙星为 2 ng / g） ， 畜禽肉及水产回收率为 70% ～ 91% ，鸡蛋回收率 为 80% ～ 93% ，能够满足我国动物源性食品中氟 喹诺酮类最高残留限量的检测要求 。 参考文献
图2 空白猪肉
使用了不同 pH 的流动相。
图3
猪肉中四种氟喹诺酮类药物添加回收
图4
提取液对提取效率的影响
2. 3
样品前处理 文献
［12 ， 13 ］
对肉及蛋中氟喹诺酮类的检测通常 采用不同的前处理方法，本文探索了肉及蛋通用 的检测方法，简便实用。 由于猪肉纤维较粗，而鸡肉纤维细短，鸽肉 有血色素干扰，蛋和鱼肉中蛋白质含量很高，因 此基质不同对检测结果有一定影响，文献中多采 用添加正己烷去脂等方法减少基质干扰，本文采 取加大提取液体积以弱化基质影响，低温高速离 心以降低蛋白质及脂类干扰，取得了较好的效果。 振摇提取 是 常 用 的 提 取 方 法，本 文 对 猪 肉、 兔肉、鸡肉、鸽肉均采取振摇提取 15 min 以提高 提取效率，结果显示效果较好。但鱼肉及蛋液不 适合长 时 间 振 摇，一 般 涡 旋 1 min 或 中 速 振 摇 3 min即可，以防止起泡，增加柱净化难度。 2. 4 提取液的选择 由于本文研究的四种沙星类均为哌嗪喹诺酮 ， 是具有两个 pKa 的两性化合物，分别为 5. 5 ～ 6. 6
表1 四种氟喹诺酮类药物标准曲线方程及相关系数 保留时间 / min 8. 387 10. 023 11. 622 18. 256 线性方程 相关 系数 表3
2. 2
添加回收实验
ຫໍສະໝຸດ Baidu
在猪肉、兔肉、鸡肉、鸽肉基质中添加三种浓 度的氟喹诺酮类药物混和对照品溶液，鸡蛋、鱼 肉基质中添加两种浓度的对照品溶液，均平行添 加三份，统计平均回收率列于表 2 ～ 4 中。畜禽肉 基质的添加回收率在 70. 2% ～ 90. 5% 之间，鸡蛋 的添加回收率在 83. 6% ～ 92. 7% 之间，鱼肉的回 收率为 71. 1% ～ 84. 1% 。图 3 为空白猪肉中添加 四种氟喹诺酮类药物混合对照品 200 ng / g（ 达氟沙 星 40 ng / g） 的添加回收谱图。
A = 2. 17 × 104 ρ － 1. 77 × 104 0. 9999 A = 1. 89 × 105 ρ － 1. 26 × 105 0. 9996 A = 4. 51 × 104 ρ － 3. 65 × 104 0. 9999 A = 1. 70 × 104 ρ － 2. 66 × 104 0. 9998
［1 ］ 中华人民共和国农业部公告第 235 号. 动物性食品 2002 中兽药最高残留限量， ［2 ］ European Union Commission. Desision No. 2002 /657 / EC，implenenting Council Dirctive 96 /23 / EC concerning the performance of analytical methods and the inter-
［3 ～ 11］
C18 固 相 萃 取 小 柱 （ 100 mg， 3cc ） ； 离 心 机 （ ALC PK121R，Thermo ） ； pH 计 （ ZD2A，上海大 普仪器有限公司） 。 H3 PO4 （ 85% ） 、三乙胺为分析纯； 磷酸氢二 钾、NaOH 为化学纯； 乙腈、甲醇为色谱纯。盐酸 环丙沙星，纯度 100% ； 恩诺沙星，纯度 99. 9% ； 沙拉沙星，纯度 99. 8% 、甲磺酸达氟沙星，纯度 99. 9% ，购自中国兽医药品监察所。 1. 2 1. 2. 1 溶液配制 对照品 精密称取环丙沙星、恩诺沙星、 沙拉沙星、达氟沙星标准品，用 0. 02 mol / L NaOH
4 ℃ 冷藏，上机前用 溶液制成 1. 0 μg / mL 贮备液， 流动相稀释成适宜浓度的标准工作液 。 1. 2. 2 磷酸盐缓冲液 称取磷酸氢二钾 6. 8 g， 加水溶解，稀释至 500 mL，用 5. 0 mol / L NaOH 溶
有关 FQNS 多残留的检测方法国外已有诸多报 ，但是不同基质的前处理方法也不同，且操
药物名称 环丙沙星 恩诺沙星 沙拉沙星 达氟沙星 表4
鱼肉基质中添加四种氟喹诺酮类药物回收率 添加浓度 w / （ ng / g） 10 ， 100 10 ， 100 10 ， 100 2， 20 平均回收率 / % 鲫鱼肉基质 71. 1 ， 79. 1 75. 7 ， 80. 8 73. 9 ， 78. 5 77. 2 ， 83. 4 冻干鱼粉基质 75. 8 ， 80. 3 76. 6 ， 82. 5 75. 2 ， 79. 4 78. 2 ， 84. 1
作步骤复杂，不利于进行批量检测。本研究在文献 方法的基础上建立了一种同时检测 4 种氟喹诺酮类 药物残留量的快速方法，适用于猪肉、鸡肉、鸽肉 和鸡蛋，优化并简化了提取和净化过程，方法简便， 灵敏快速，能满足国内外检测限量要求。 1 实验材料及方法 1. 1 仪器与试剂 Waters 2695 高效液相色谱仪， 配荧光检测器；
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合对照品 10 ng / g，使用两种提取液提取，本文选 用的 pH = 6. 0 的磷酸盐提取液的提取效率较某文 献中的使用的有机溶剂提取液的提取效率高 。 2. 5 pH 流动相 pH 在 2. 3 ～ 2. 4 范围内时，荧光响应 强度较适宜，应使用 pH 计精密调节。图 5 为鸽肉 中添加四种氟喹诺酮类药物混合对照品 10 ng / g （ 达氟沙星 2 ng / g ） 的添加回收色谱图，两次进样
张 鑫，李丹妮，张文刚，严 凤，蒋 音，顾 欣
*
（ 上海市兽药饲料检测所，上海 201103 ） 要： 建立了适用于批量检测的，快速测定畜禽肉、蛋及水产中环丙沙星、 达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星药物残留的高效液相色谱方法，并且能够满足 摘 我国动物源性食品中氟喹诺酮类最高残留限量的检测要求。用缓冲盐溶液提 取，C18 固相萃取小柱净化，高效液相色谱荧光检测器同时检测四种氟喹诺酮 类药物。环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星定量限为 10 ng / g，达氟沙星定量限为 2 ng / g，回收率 70% ～ 93% 。本方法可用于猪肉、兔肉、鸡肉、鸡蛋、鸽肉及鱼 肉中氟喹诺酮类药物残留的快速定量测定 。 关键词： 残留； 氟喹诺酮类； 环丙沙星； 达氟沙星； 恩诺沙星； 沙拉沙星； 高效 液相色谱 氟喹诺酮类药物 （ Fluoroquinolones，FQNS ） 是 新一代广谱抗菌全合成抗菌素，高效低毒，价格 低廉，少量使用还具有一定的促生长作用，因此 近年来被广泛应用在兽医学中用于预防和治疗畜 禽及鱼类疾病。但是该类药物在动物体内消除缓 慢，过量使用或使用不当会造成动物产品中药物 残留； 人体摄入后可能导致细菌耐药性问题，并 对中枢神经系统造成不良反应。因此，氟喹诺酮 类药物的残留问题越来越引起人们的重视。我国 和欧盟规定在动物源性食品中氟喹诺酮类最高残 ［1 ］ 留限量 0. 01 ～ 1. 9 mg / kg ，日本在 2006 年执行 的新的肯定列表制度中氟喹诺酮类药物的检测限 ［2 ］ 量 0. 01 ～ 0. 05 mg / kg 。 道
* 作者简介： 张
液调节 pH 至 6. 0 。 1. 2. 3 0. 05 mol / L 磷 酸 / 三 乙 胺 溶 液 取 浓 H3 PO4 3. 4 mL，用水稀释至 1000 mL。用三乙胺调 pH 至 2. 3 ～ 2. 4 。 色谱条件 色谱柱： C18 柱 250 × 4. 6 mm （ i. d. ） ，粒 径 5 μm； 流动相： 0. 05 mol / L 磷酸 / 三乙胺 ∶ 乙腈 = 1. 3 84∶ 16 ； 流速 1mL / min； 柱温 30 ℃ ； 进样量 20 μL；
表2 畜禽肉基质中添加四种氟喹诺酮类药物回收率 添加浓度 w / （ ng / g） 10 100 200 恩诺沙星 10 100 200 沙拉沙星 10 100 200 达氟沙星 2 20 40 平均回收率 / % 猪肉 基质 72. 1 81. 5 88. 3 75. 7 86. 3 90. 5 73. 9 80. 5 82. 6 77. 2 83. 4 89. 3 兔肉 基质 73. 2 80. 3 85. 5 77. 1 86. 5 88. 3 72. 5 77. 8 79. 5 76. 8 82. 3 87. 6 鸡肉 基质 71. 8 84. 3 86. 5 76. 6 88. 5 89. 8 70. 2 75. 4 80. 5 78. 2 84. 1 86. 3 鸽肉 基质 71. 7 83. 3 85. 2 75. 3 85. 4 88. 2 72. 3 71. 5 74. 6 76. 5 85. 8 88. 3
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药物名称 环丙沙星 恩诺沙星 沙拉沙星 达氟沙星 图1 四种氟喹诺酮类药物混合对照品谱图 收实验
* 冻干鱼粉加 4 倍重量的纯水溶胀 10 min，再进行添加回
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mail： guxun@ sh163. net 鑫 （ 1983 － ） ，女，助理畜牧师； E-
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荧光检测器，激发波长 280 nm，发射波长 450 nm。 1. 4 实验原理 样品经匀浆后，试样中残留的氟喹诺酮类药 物用磷酸盐缓冲液（ pH 6 ） 提取，用 C18 固相萃取小 柱净化，流动相洗脱，洗脱液过滤上机，用高效液 荧光检测法测定。 相色谱1. 5 样品处理 取适量样品用匀浆机匀浆。准确称取匀浆后 的样品 2. 0 g，加入 20 mL 磷酸盐缓冲液，振荡提 8000 r / min 4 ℃ 低温离心 10 min，转移 取 10 min， 清液于另一 50 mL 离心管中备用。依次用甲醇、 水、磷酸盐缓冲液 3 mL 活化洗涤 C18 固相萃取小 柱。加入样品提取液 5 mL，控制 2 ～ 3 滴 / s 流速， 用 3 mL 水洗涤杂质，挤干，用 2 mL 流动相洗脱， 混匀，取 1 mL 经 0. 45 μm 滤膜过滤后供高效液相 色仪谱检测。 2 结果与讨论 2. 1 标准曲线 分别吸取一定量的 4 种氟喹诺酮类药物的储 备液于同一容量瓶中，用流动相稀释成环丙沙星、 恩诺沙星、沙拉沙星浓度为 5 、10 、20 、50 、100 、 250 ng / mL， 2、 4、 10、 20、 50 ng / mL 的 达氟沙星为 1、 混合对照品工作液。药物峰面积 A 与相应浓度 ρ （ ng / mL） 的拟合线性方程和相关系数如表 1 。