分子克隆技术

对临床菌株的第二次PCR 扩增产物电泳图谱分析
Lane 1~7: 临床菌株S. sobrinus;
Lane 8~14:临床菌株 S.mutans.
核酸杂交
原理：
在一定条件下（温度、pH值等）DNA
双股螺旋可解开并分离
在一定条件下，两股游离的互补的核苷
酸可自行配对形成双股
Southern Blot
Ct值
Real Time PCR原理（二）

再由Ct值（达到阈值时的循环次数）与起始模板量的 对数值之间存在的线性关系，就可以制作成下图所示 的标准曲线。未知浓度的样品与标准品相同，也可以 得到Ct值，将Ct值代入标准曲线，就可以求出未知浓 度样品的起始模板量。
未知样品浓度
分子克隆的主要步骤
基因文库的建立 目的基因的筛选 目的基因的分析
Inter primer thp10
Inter primer thp7
The second PCR
Inter primer thp9
The second PCR

抽提细菌染色体DNA（Igarashi et al.1996）
----细菌 ----唾液

PCR反应过程 第一次PCR反应
预变性:
变性: 退火: 延伸 : 最后延伸:
分子克隆技术
限制性内切酶
特定的识别序列，4~6个碱基对 在识别序列内固定位置切割，5'-端磷酸
基因， 3'-端羟基基团
切割后形成粘性或平滑末端
限制性内切酶和DNA连接酶
…C A T C G A C G A A T T C
…G T A G C T G C T T A A G
EcoRI酶切
• 在人类口腔中检出率很高
• 茸毛链球菌可能比变形链球菌与龋损
活跃性之间的关系更密切
唾液在与龋病相关微生物检测中的应用 套式PCR快速检测人类唾液中变形链
球菌和茸毛链球菌.
谭海平，边专，樊明文，陈智，范兵. 中华口腔医学杂志，2003，38：223-226
套式PCR（Nested PCR ）
5′
94℃ 4min
94℃ 1min 51℃ 1min 72℃ 2min 72℃ 5min 30 cycles
第二次PCR反应
a
MW
b 2
c 3
d e 4 5
f 6
g 7
h 8
Ladder 1
(Kb)2.0 1.0 0.75
0.5
0.25 0.1
选择外引物行第一次PCR后扩增产物电泳图谱分析 以变链菌组 (Mutans Streptococci)染色体 DNA为模板
G A A T T C T G C C A G G T…
C T T A A G A C G G T C C A…
位点
双 链 切 开
…C A T C G A C G …G T A G C T G C T T A A
AA T T C G
DNA
G C T TAA 连 接 酶
A A T T C T G C C A G G T… G A C G G T C C A…
Lane 1: S.cricetus AHT; 4. S.sobrinus OMZ176; 7. S.sobrinus 6715; 2.S. rattus BHT; 5.S.mutans LM-7; 8. S.downei Mfe28. 3.S.mutans Ingbritt; 6. S.mutans OMZ175;
…C A T C G A C G A A T T C T G C C A G G T.. ..G T A G C T G C T T A A G A C G G T C C A..
形成新的DNA双链
质 粒
细胞内独立于染色体外的环状DNA，能 自我复制 其上基因可借助宿主细胞的转录、翻译 系统得以表达 分子2000~50000bp
电泳、转移、杂交 确定分子量
斑点杂交
目标序列的存在 目标序列的量
聚合酶链反应PCR
唾液在与龋病相关微生物检测中的应用
与龋病相关微生物的定量检测方法
细菌形态 生化反应 免疫反应 分子生物学方法 ----分子探针杂交 ----RFLP ----PCR

唾液在与龋病相关微生物检测中的应用 变形链球菌和茸毛链球菌
gtfB gene of S.mutans
Outer primer thp3
Outer primer thp4
gtfI gene of S.sobrinus
Outer primer thp6
The first PCR Inter primer thp8
Outer primer thp5
The first PCR
Ladder
1
2
3
4
5
6
第二次PCR的灵敏度
变形链球菌S.mutans Ingbritt 的数量 Lane 1: 104 CFU, Lane 2: 103 CFU
Ladder
1
2
3
4
5 Ladder MW 2.0
Ladder
1
2
3
4
5 Ladder
(Kb)
(Kb)
MW
1.0 0.75 0.5 0.25
原核生物基因文库的建立
提取细胞DNA 限制性内切酶酶切 DNA片段连接至质粒或噬菌体 转化宿主细胞（大肠杆菌）
目的基因的筛选
核酸杂交 免疫学检测
目的基因的分析
DNA序列
启动子分析
推测蛋白质一级结构
推测蛋白质二级结构

Real Time PCR应用
基因表达分析（mRNA）
SNP分型
基因拷贝数变化（DNA） 转基因食物的定量分析 ……
Real Time PCR原理（一）

PCR每进行1个循环，DNA呈2倍的指数关系增长， 不久到达平台期。起始 的DNA量越多扩增产物便越 早达到阈值，也就是扩增曲线越早起峰。将已知浓度 的标准品梯度稀释进行Real Time PCR，就会按照起 始DNA量由多到少的顺序等间隔得到一系列曲线。
a MW Ladder 1 (Kb)2.0 1.0 0.75 0.5 0.25 0.1
b 2
c 3
d 4
e 5
f 6
g 7
h 8
选择内引物行第二次PCR后扩增产物电泳图谱分析
Lane 1: S.cricetus AHT; 2.S. rattus BHT; 3.S.mutans Ingbritt; 4. S.sobrinus OMZ176; 5.S.mutans LM-7: 6. S.mutans OMZ175; 7. S.sobrinus 6715; 8. S.downei Mfe28. Marker: DL2,000 Ladder
转
录
利用噬菌体为媒介，将供体DNA转移到受
体菌内的现象，能在自然状态下发生。
分子克隆常用技术
DNA电泳
基因转移
核酸杂交
聚合酶链反应PCR
DNA电泳
可分离不同分子量的DNA
Ladder 1 2 3 4
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Ladder
MW
(Kb) 2.0 1.0 0.75 0.5 0.25 0.1
Template
Outer primer2
3′
Outer primer1
The first PCR
5′ Next template
Inter primer2
3′
Inter primer 1
The second PCR
5′
The second PCR product
3′
本套式PCR的引物是分别根据变形链球菌gtfB基因 和茸毛链球菌gtfI基因设计的内、外两套引物 （outer primer, inter primer）
利用PCR直接从唾液样本中检测变形链球菌S.mutans和茸毛 链球菌S.sobrinus(图A)利用外引物(图B)利用内引物
Real Time PCR

在PCR反应体系中加入能结合到扩增产物 上的荧光物质，并通过Real Time PCR检 测系统对PCR反应过程中的荧光信号强度 进行实时监测，最终对实验数据进行分析 处理的方法 适应于定量
多克隆区：人为构建，便于克隆操作 选择因子：含特定基因，如耐抗生素基因， 使克隆后便于挑选
接
合
在适当的条件下，雄性菌和雌性菌混合时 形成配对的雄性-雌性菌，并有遗传物质的 单向转移。 雄性菌：含F性因子，染色体外环状DNA
转
化Байду номын сангаас
外源DNA能进入细胞内并通过整合至宿主 DNA中或独立复制保存于宿主细胞内。
1.0 0.75 0.5 0.25
A
0.1
B
0.1
2.chromosomal DNA from S.sobrinus 6715; 4.saliva sample from subject B;
Lane1.chromosomal DNA from S.mutans Ingbritt; 3.saliva sample from subject A; 5.saliva sample from subject C.

pGEM-T vector map
Sub-cloning
construction of
recombinant pCIA-P
insertion of A-P
DNA fragment into plasmid pCI
构建质粒的特点

Ori区：复制起点
Par区：保证质粒均匀分布于子细胞
MW Ladder
(Kb)
1
2
3
4
5
6
2.0
1.0 0.75
0.5 0.25
第一次PCR的灵敏度
变形链球菌S.mutans Ingbritt 的数量
Lane1: 108 CFU; Lane3: 106CFU; Lane 2: 107 CFU; Lane 4:105 CFU
MW (Kb) 2.0 1.0 0.75 0.5 0.25