电镜样品制备

电子显微镜样品的制备

一、透射电镜样品超薄切片常规制作规程

1．取材：根据实验目的取材，要求部位准确，体积小于2mm3

2．醛类固定：用2%-3%的戊二醛固定2小时；

3．清洗：用磷酸缓冲液清洗3次，每次10min；

4．锇酸固定：用1%-2%的锇酸固定2~3小时；

5．清洗：用磷酸缓冲液清洗3次，每次10 min；

6．脱水：用50%、70%、80%、90%乙醇梯度脱水各15min，再用100%乙醇脱水3次，每次30min；

7．置换：用环氧丙烷或丙酮置换3次，每次30min;

8.浸渍：10hr以上，浸渍过程如下：

①丙酮：包埋剂=3：1的浸渍液浸渍（动物样品1hr，植物样品2~3hr）；

②丙酮：包埋剂=1：1的浸渍液浸渍（动物样品1hr，植物样品2~3hr）；

③丙酮：包埋剂=1：3的浸渍液浸渍（动物样品4hr，植物样品12~24hr）；

④纯包埋剂浸渍（动物样品4hr，植物样品12~24hr）；

9．包埋：将样品放入盛有纯包埋剂的包埋板中；

包埋剂配方中Epon812，MNA，DDSA，DMP-30的比例见附表

10．聚合：将包埋板置于40C、60℃条件下各聚合48hr；

11．修块：将包埋头修成梯形，且样品表面积小于0.2mm×0.2mm

12．超薄切片：切片厚度50-90nm

13．染色：铀染色 5~15min 清洗

铅染色 5~10min 清洗

二、扫描电镜样品常规制备规程

1．取材：根据实验目的取材，要求部位准确

2．清洗：用磷酸缓冲液反复清洗样品表面的灰尘、杂质等附着物

3．固定：用2%-3%的戊二醛固定2小时

4．清洗：用磷酸缓冲液清洗3次，每次10 min

5．脱水：用50%、70%、80%、90%乙醇梯度脱水各15min，再用100%乙醇脱水3次，每次30min；

6．置换：用叔丁醇置换3次，每次30min

7．干燥：用冷冻干燥仪干燥样品

8．粘样：用双面胶带将样品粘到样品台上

9．镀膜：用离子溅射仪给样品镀10nm金膜

（二）电镜样品制备技术

电镜样品制备技术较复杂，种类也较多，分为普通样品制备技术和特殊样品制备技术。这里简单介绍几种常用的样品制备技术。

1、超薄切片技术

超薄切片技术（ultramicrotomy）是透射电镜样品制备方法中最基本的一种。由于电子束穿透能力的限制透射电镜观察的样品必须很薄，普通光镜切片厚度约3～5µm，而透射电镜切片厚度则要求在50～80nm左右。这种薄切片称为超薄切片。超薄切片技术包括：取材、固定、脱水、浸透、包埋、切片及染色。

电镜样品采用戊二醛和锇酸双重固定，用酒精或丙酮脱水，环氧树脂进行包埋，

超薄切片机切片，采用重金属如铀和铅进行染色以增加细胞结构间的反差。

2、负染色技术

负染色技术（nagtive stain technique）又称阴性染色，是透射电镜样品制备技术中的一种。此技术是指通过重金属盐在样品四周堆积而加强样品外周的电子密度，使样品显示负反差，衬托出样品的形态和大小。常用的重金属有磷钨酸钠、醋酸铀等。

负染色技术主要用于细菌、病毒、噬菌体等微生物大分子结构、亚细胞碎片以及分离的细胞器等研究工作。负染色样品不需经过固定、脱水包埋和超薄切片等复杂操作，而是直接对沉降的样品匀浆悬浮液进行染色。

3、冷冻蚀刻技术

冷冻蚀刻技术（freeze-etching technique）又称冷冻复型，是透射电镜样品制备技术的一种，是将样品经快速冷冻→断裂→升华→喷铂→喷碳而最终形成一层印有生物样品断裂面立体结构的复型膜，然后将生物样品腐蚀掉，用铜网将复型膜捞起进行透射电镜观察。

冷冻蚀刻技术能保持细胞原来的结构，立体感鲜明，主要用于生物膜的研究。

4、扫描电镜样品制备技术

扫描电镜适合于研究生物样品的表面特征，样品制备包括观察面的暴露、固定、脱水、干燥和导电等。

样品制备采用戊二醛和锇酸双重固定；乙醇或丙酮脱水。干燥是扫描电镜样品较

重要的步骤。由于生物样品柔软多水，大多数的组织含水量在80%以上，采用自然干燥，会受表面张力影响使细胞表面收缩，形态改变。所以多采用液体CO2临界点干燥法，在临界状态时表面张力系数为零，也就是分子的内聚力等于零时干燥，细胞不再收缩，保持了原有的形态。由于干燥样品不导电，因而需要在样品表面镀一层薄薄的金属膜使样品导电并增加图像的反差和立体感。