免疫检测技术的基本原理

凝集试验
➢ 概念：颗粒性抗原(细菌、红细胞等)与相应抗 体结合，在一定条件下出现肉眼可见的凝集物 ，称为凝集反应。
1.直接凝集反应 ➢抗原与抗体直接混合作用，出现凝集为阳
性结果。 ➢①玻片直接凝集法：定性试验 ➢②试管直接凝集法：半定量试验
玻片直接凝集试验
+
试管法半定量试验
1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512
（nm) 16 24.5 41 71.5
（ml)* 2.00 1.50 1.00 0.70
胶体金特性
呈色 橙色 橙红色 红色 紫色
lmax(n m) 518
522
525
535
*还原100 ml0.01%HAuCl4 所需量
胶 体 金（Colloidal Gold） 15~60 nm
优质
劣质
胶体金结合物（Conjugate）
一、免疫渗滤测定(IFA)
斑点渗漏法
▪ 其原理与层析法相类同，中心圆点为一株 单抗，边上小点为抗鼠二抗。先将待测样 品滴在其中，若有抗原即被结合在中心圆 点，洗去未结合抗原，再滴加金标另一株 单抗，若有抗原则形成金-Ab-Ag•薄膜的红 色斑点，而边上是金-Ab-Ab2•薄膜的质控 点，是为金标二步法。
ICA 结果观察
阳性 阴性 无效
IFA与ICA的比较
IFA
ICA
试剂形式 试剂保存
渗滤装置及附 加试剂
4~8℃ 6个月
试剂条 室温一年
操作步骤
3~5
1
观察时间
3 min
3~20 min
阳性反应颜色 操作结束颜色 颜色逐渐加深
浓度
不变
IFA 穿流（FLOW THROUGH
）
ICA 横流（LATERAL FLOW）
▪ 1、 罗立新, 缪珑, 潘力, 等. 快速检测产单核李 斯特菌免疫胶体金层析法的研究[J]. 中国卫生 检验杂志, 2006, 16(2): 154-156.
▪ 2、 赖卫华, 熊勇华, 陈高明, 等. 应用胶体金试 纸条快速检测赭曲霉毒素A的研究[J]. 食品科 学, 2005, 26(5): 204-207.
的复合物
洗涤除去其他 未结合的物质
彻底洗涤 未结合的 酶标抗体
加底物进行 酶催化反应
根据颜色反应的 程度进行该抗原 的定性或定量测定
（二）间接法
间接法是检 测抗体最常用的方 法，其原理为利用 酶标记的抗抗体以 检测已与固相结合 的受检抗体，故称 为间接法。
酶联免疫吸附试验(ELISA-间接法)
包被固相载体: 用已知抗原包被
唑啉磺酸-6)铵盐
碱性磷酸酯酶
4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐
葡萄糖氧化酶
ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰
β-Ｄ－半乳糖 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)
苷酶
硝基酚半乳糖苷(ONPG)
显色 测定波长 反应
橘红色 492 黄色 460 棕色 449 兰色 425 蓝绿色 642
例：乳胶凝集抑制试验检测HCG (妊娠诊断)
已知抗体
＋
待检标本 步骤1：将已知抗体 与待检标本混匀
抗原吸附 乳胶颗粒
＋
步骤2：加入抗原 吸附的乳胶颗粒混 匀
结果判断：
不凝集为 阳性结果
凝集反应
2.沉淀反应
概念：可溶性抗原与相应抗体结合后出 现沉淀物称沉淀反应。
类型： ★单向免疫扩散 ★双向免疫扩散 ★对流免疫电泳 ★免疫比浊法
荧光抗体技术的原理与方法
➢ 用荧光素标记抗原或抗体，再与标本中抗体或抗 原反应，然后在荧光显微镜下观察，形成的IC可 散发出荧光，对标本中的抗原或抗体进行测定和 定位。
➢ 常用的荧光素
➢ 异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)等。
➢ 常用的方法
➢ 直接荧光法 ➢ 间接荧光法
免疫荧光技术
免疫荧光技术——直接法
（一）双抗体夹心法
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原
获得待分析物的未标定抗体
将特异性抗体与固相 载体连接形成固相抗体
加入封闭蛋白溶液以封闭载体 表面残留的蛋白结合位点
洗涤除去未结合的 抗体及杂质
洗涤并除去未结合的封闭蛋白
加受检标本（抗原）形成 固相抗体－抗原复合物
加酶标抗体生成 抗体—待测抗原—酶标记抗体
斑点金免疫层析试验（一）
兔抗鼠IgG 鼠抗HCG单抗 金标鼠抗HCG单抗
手持端 尿液浸湿标志线
斑点金免疫层析试验（二）
质控线 测试线
尿样
阳性 弱阳性 阴性 无效
ICA——双抗体夹心法测抗原
ICA--- 竞争法测抗原
免疫层析试验竞争法测小分子抗原原理图
ICA 竟争法结果观察
阴性 阳性 无效
ICA——间接法测抗体
测定管加待测抗原和 一定量的酶标抗原使二者与
固相抗体竞争结合
对照管只加一定量酶标抗原 与固相抗体直接结合
加底物显色
分别测定两管的吸光度值， 根据对照管与测定管吸光度值之比，
计算标本中待测抗原含量
分别洗涤 除去未结合
的成分
对照管由于只加酶标抗原，与固 相抗体充分结合，故分解底物显色深； 测定管的显色程度则随待测抗原和酶 标抗原与固相抗体竞争结合的结果而 异。如待测抗原量多，竞争性地抑制 酶标抗原与固相抗体结合，使固相上 结合的酶标抗原量减少。因此，加入 底物后显色反应较弱。
戊二醛交联法（二步法）
COH-（CH2）3-COH + NH2-酶 抗体-NH2 + CHO-（CH2）3-CH = NH2-酶
抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶
过碘酸盐氧化法
O O
NaIO4
酶-五炭糖环
O O
O
O
+ NH2抗体
O NaBH4 O
OH N
O
抗体
Schiff碱
免疫金标记技术
▪ 免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的 特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐 色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集 时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性 或半定量的快速免疫检测。这一反应也可以通过 银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色（ immunogold silver staining，IGSS）。
荧光素标记的 特异性抗体
Ag 组织切片
免疫荧光技术——间接法
待测抗体
荧光素标记 的抗抗体
Ag 组织切片
免疫荧光技术
荧光显微镜
荧光显微镜使用原理
激发滤片（BG） 标本 吸收滤片（OG）
FITC吸收光峰值：490-495nm FITC发射光峰值：520-530nm
BG：325-500
OG：410-650
O O
N
抗体
H2O
O O
N
OH
OH
抗体
标记免疫物的分离与鉴定
1、分离 目的：去除游离酶 方法：盐析、柱层析
2、鉴定 抗体活性 酶活性 标记物纯度
ELISA的种类和变化
（一）双抗体夹心法 （二）间接法 （三）竞争法 （四）双位点一步法 （五）捕获法测IgM抗体 （六）应用亲和素和生物素的ELISA
IFA——双抗体夹心法测抗原
A
Bwk.baidu.com
IFA——结果判断
InstantChek HIV 1+2的结果判断 (图 像)
阳性
阴性
测定无效
二、免疫层析测定（ ICA ）
层析法
▪ 将金标的一株单抗吸附于下端的玻璃纤维 纸上，浸入尿液，此金标单抗即被溶解， 并随尿液上行，若尿中有相应抗原，既形 成Ag-Ab-金复合物，当上行至中段醋酸纤 维薄膜，即与下端的另一株单抗结合并被 固定下来，显示阳性结果。其上方还有一 条抗鼠二抗，待红色金标单抗上行此处即 被固定下来，作为金标单抗质控的提示。 此种方法称金标一步法。
单向琼脂扩散试验
双向琼脂扩散试验
对流免疫电泳
免疫比浊法原理
抗体 抗原
免疫复合物的 浓度与透射光 的衰减呈正相 关
测吸光度 计算抗原 或抗体的 含量
3.中和反应 如抗“O”试验
4.免疫标记技术
概念：用荧光素、酶、同位素等 标记抗体或抗原用以测定相应抗原或 抗体的技术称为免疫标记技术。常用 方法有免疫荧光技术、酶免疫技术、 放射免疫检测技术等。
2.间接凝集法
➢ 先将可溶性抗原或抗体吸附在颗粒载体上 (如RBC, 乳胶颗粒)，再与相应抗体或抗 原反应，出现凝集为阳性结果。
➢ 临床常用的有间接血凝试验、乳胶凝集试 验等。
待检样品
抗原吸附血球 或乳胶颗粒
反应凝集物
+
→
3.间接凝集抑制试验
➢ 先将待检抗原与已知的抗体反应，再加入用已知 抗原吸附的载体颗粒，不出现凝集为阳性结果。
特点：敏感、特异、快速，能定 性、定量、定位。
免疫标记技术
▪ 酶免疫标记技术 ▪ 荧光免疫分析技术 ▪ 放射免疫分析技术 ▪ 免疫金标记技术
酶联免疫吸附试验
▪ 1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰 学者Van Weerman和Schuurs分别报道将 免疫技术发展为检测体液中微量物质的固 相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA)
ELISA在饲料安全检测中的应用
饲料中盐酸克伦特罗的测定 饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素， 简曲霉毒素 ） 饲料中有害微生物的快速筛检 （如沙门氏 菌）
ELISA用于农药残留的检测
甲胺磷残留分析 甲基对硫磷残留分析 呋喃丹残留分析
农药的检测：
主要有除草剂与杀虫剂两大类 例如杀暝松（ FN ）、 甲氟磷酸异已酶（ SOMAN ）、 草不绿（ Alachor ）、 西维因（ Carbaryl ）、 多菌灵及克菌丹（ Captan ）等。
一、胶体金制备
胶体金（colloidal gold）的制备一般采用还 原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏 血酸、白磷、硼氢化钠等。向一定浓度的金溶 液内加入一定量的还原剂使金离子还原成金原 子，形成金颗粒悬液，也称金溶胶（gold solution）。
胶体金的制备及特性
胶体金粒径 1%柠檬酸钠加入量
酶及其底物
酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原 在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败 的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的 免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物 放大作用，但不同的酶选用不同的底物 ， 将得到不同的颜色反应.
酶
底物
辣根过氧化物酶
邻苯二胺 四甲替联苯胺 氨基水杨酸 邻联苯甲胺 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻
▪ 3、 谌志强, 段惠莉, 王新为, 等. 大肠埃希 菌O157:H7的胶体金免疫渗滤法检测[J]. 中 国公共卫生, 2005, 21(4): 705-706.
▪ 4、 谢昭聪, 宋志强, 吕敬章, 等. 应用胶体 金免疫层析法检测水产品中霍乱弧菌的研 究[J]. 中国国境卫生检疫杂志, 2005, 28(3):
第三节免疫检测技术的基本原理
▪ 抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原 检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未 知的抗原 .
▪ 将免疫反应与现代测试技术结合 ▪ 超微量的检测
免疫学检测技术的优点
▪ 高度的灵敏性 ▪ 高度的特异性
免疫分析技术的应用
▪ 常用的诊断技术 血凝试验 酶联免疫吸附试验 胶体金免疫技术 放射免疫分析技术
163-165.
▪ 5、 王中民, 李君文, 王新为, 等. 免疫金渗滤试 验检测食品中沙门氏菌的研究[J]. 微生物学免 疫学进展, 2001, 29(4): 45-47.
植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素
河豚毒素
苯并芘
食源性病原菌检测试剂盒
大肠杆菌检测 沙门氏菌检测 单增李斯特菌 金黄色葡萄球菌
食品其他检测：
转基因成份的检测：如转基因玉米中中的cry9e蛋白 转基因大豆中的CP4 EPSPS蛋白质．
肉制品的掺假检测： 以辣根过氧化物酶标记不同动物肌肉和血清球蛋A
抗血清检查牛肉、马肉、猪肉、羊肉和驼肉检测14种 畜禽熟肉制品，包括牛肉、羊肉、鹿肉和马肉等，在 掺假率为1%时即可检出
固相载体
加待检标本: 使相应抗体与固相抗原结合
洗涤，除去无关的物质
加底物 显色
根据颜色反应的程度进行 该抗原的定性或定量测定
加酶标抗抗体: 与固相载体上抗原抗体 复合物结合；洗涤，除去 未结合的酶标抗抗体
（三）竞争法
此法可用于抗原和半抗原的定 量测定，也可用于测定抗体 。
用已知特异性 抗体包被 固相载体
黄色 400 红色 500
黄色 405 深蓝色 420
荧光 黄色
360,450 420
▪ 2、标记方法 ▪ 戊二醛交联法 ▪ 过碘酸盐氧化法
戊二醛交联法 (一步法）
抗体-NH2 + COH-（CH2）3-COH + NH2-酶
抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶 抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-抗体 酶-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶