酵母双杂交实验步骤

LexA酵母双杂交系统简介

一、LexA酵母双杂交系统的设计原理

报告质粒p8op-LacZ的GAL4 UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下，报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3，可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。

质粒pLexA的筛选标志为HIS3，在双杂交系统中用于表达DNA-BD(202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白(钓饵，Bait)的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控，选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。

质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I与Xho I)上游，含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(来自于的88个氨基酸残基组成的B42蛋白)等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu，它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA，但两者启动子不同。

根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活报告基因的转录和表达。分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含有报告基因的酵母菌株，如果蛋白X与Y能相互作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。

如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库，则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。

二、商品化酵母双杂交系统的组成

1. 载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库

2. 酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侣菌株）

3. 大肠杆菌菌株： KC8株

4. 对照质粒：

质粒用途

pLexA-53，pB42AD-T 阳性对照

pLexA-Pos(LexA/GAL4 AD融合蛋白〕阳性对照

pLexA-Lam(LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用) 假阳性检测质粒

5. 引物：

pLexA测序引物及pB42AD测序引物。

三、酵母双杂交实验的基本流程

1. 将报告基因p8op-LacZ转化酵母EGY48菌株，用培养基SD/-Ura筛选。

2. 同时构建或扩增DNA文库，并纯化足够的质粒以转化酵母细胞。

3. 构建DNA-BD/靶蛋白质粒pLexA-X，作为钓饵(bait)。

4. 将上述钓饵质粒pLexA-X转化EGY48(p8op-LacZ)细胞株，用SD/-His/-Ura筛选；并用固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Ura检测此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活报告基因的活性，以及对酵母细胞是否具有杀伤毒性。

转化质粒选择培养基克隆生长情况说明

(含有Gal/Raf)

pLexA-Pos SD/-His，-Ura 蓝阳性对照

pLexA SD/-His，-Ura 白阴性对照

PlexA-X SD/-His，-Ura 白没有直接激活活性

PlexA-X SD/-His，-Ura 蓝具有直接激活活性

PlexA-X SD/-His，-Ura 菌落不能生长酵母细胞毒性

4-1. 如果pLexA-X -半乳糖苷酶的信号作用。能够自动激活报告基因，则设法去除其激活活性部位、或者将LacZ报告基因整合入基因组，减少

4-2. 如果pLexA-X虽然不会自动激活报告基因，但对酵母宿主细胞有毒性，则需要与纯

化的文库DNA同时转化酵母。

5. 如果pLexA-X既不会自动激活报告基因，也不具有毒性，则可以与纯化的文库DNA 同时、或顺序转化酵母细胞，并检测质粒转化效率。

转化质粒SD固体培养基LacZ表型

对照1 pLexA-Pos Gal/Raf/-His/-Ura 蓝

对照2 pLexA-53 Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu 蓝

＋pB42AD-T

实验pLexA-X Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu 待测

＋pB42AD-文库

5-1. 用SD/-His/-Trp/-Ura培养基选择阳性共转化子，并扩增，使宿主细胞中的质粒在诱导前达到最大拷贝数。

-半乳糖苷酶无表达。5-2. 上述重组子转至含X-gal的固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu，观察LacZ及Leu报告基因的表达情形，蓝色克隆即为阳性。白色克隆为假阳性，说明Leu虽有表达，但

5-3. 同时用LacZ、Leu两个报告基因的目的，是为了尽可能消除实验的假阳性误差，譬如：AD融合蛋白不与目标蛋白结合，而直接与启动子序列结合域结合等情况。由于2个报告基因的启动子不同，出现上述假阳性的几率就大大减少了。

5-4. 将蓝色阳性克隆进行1次以上的划种，尽可能分离克隆中的多种文库质粒。

6. 阳性克隆的筛选

6-1. 随机选取50个阳性克隆，扩增、抽提酵母质粒，电转化 KC8宿主菌，抽提大肠杆菌中的质粒，酶切鉴定是否具有插入片段及排除相同的文库质粒。

6-2. 如果重复的插入序列较多，可另取50个阳性克隆来分析。最后得到数种片段大小不同的插入序列，再转化新的宿主细胞，检测是否仍为阳性克隆。

7. 用质粒自然分选法(Natural Segregation)筛除只含有AD-文库杂合子的克隆

7-1. 将初步得到的阳性克隆接种SD/-Trp/-Ura液体培养基，培养1-2天，含有HIS3编码序列的BD-靶质粒在含有外源His培养基中，将以10％-20％左右的频率随机丢失。

C孵育2-3天。7-2. 将上述克隆，转铺固体培养基SD/-Trp/-Ura，30

7-3. 再挑取生长的单克隆，转入SD/-Trp/-Ura和SD/-His/-Trp/-Ura培养基中，筛选His表型缺陷的克隆，即得到只含有AD-文库杂合子的重组子。

7-4. 将His表型缺陷的克隆转化固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-Trp/-Ura，以验证AD-文库能否直接激活报告基因的表达，弃去阳性克隆，保留阴性克隆。

8. 酵母杂合试验(Yeast Mating)确定真阳性克隆

如下表所示，在酵母EGY48及其对应的YM4271宿主细胞中分别转入相应的质粒或文库DNA，通过杂合实验确筛选pLexA-靶DNA与pB42AD-文库确实具有相互作用的真阳性克隆。

质粒1

(in YM4271) 质粒2

(in EGY48) LacZ表型Leu表型

pLexA pB42AD 白不能生长

pLexA-靶DNA pB42AD 白不能生长

pLexA pB42AD-文库白不能生长

pLexA-靶DNA pB42AD-文库蓝真阳性

pLexA-Lam pB42AD-文库白不能生长

9. 阳性克隆的进一步筛选和确证

9-1. 扩增初步确定的阳性克隆，抽提酵母DNA。该DNA为混合成份，既含有酵母基因组DNA，也含有3种转化的质粒DNA。

9-2. 将上述DNA电转化 KC8宿主菌。由于在大肠杆菌中，具有不同复制起始调控序列