单增李斯特菌免疫胶体金试纸条快速检测
单增李斯特氏菌快速检测方法的建立
Ｋ ｅ ｒ ｓ： ｓｅ ｉ ｎ ｃ ｔｇ ｎ ｓ ｒ ｐ ｄｄ ｔ ｃｉｎ ｉｏｈ ｒ ｌａ ｌ ｃ ｔ ｎ ｙ ｗｏ ｄ Ｌｉｔｒａｍｏ ｏ ｙｏ ｅ ｅ ； ａ ｉ ｅｅ ｔｏ ；ｓ ｔｅ ｍａ ｍｐ ｉ ａｉ ｉ ｆ ｏ
敏度 高， 适合 于单增李斯特 氏菌快速筛选检测 。 关键词 ： 单增李斯特氏菌 ； 快速检测 ； 等温扩增
Ｒａ ｉ ｔ ｃｉ ｎ ｏ ｓｅ ｉ ｏ ｃ Ｗｇｅ ｓ ｐ ｄ Ｄｅｅ ｔｏ ｆＬｉｔ ｒａ Ｍ ｎｏ ｙ ｎｅ
ＬＩ Ｙａ ｇ， Ｕ ｎ ＺＨＡＮＧ ｉ ｉ ｇ， Ｉ Ｇｕ — ｏ ｇ， Ｈａ－ｙｎ Ｌ Ｕ ｏ ｈ ｎ ＺＨＡＮＧ ｎ － ｉ ， Ｈｏ ｇ ｗｅ ＺＨＡＮＧ ａ’ 一 Ｘｉ
（． ｉ ｊ ｎｒ— ｘ ｓｅｔ ｎ ｎ ｕｒｎ ｎ ｕｅｕ Ｔａｊ ０４ １Ｃ ｉａ２ ｉ ｊ ｎ ｅｓｙ ｆＳｉ ｃ ＆ １Ｔａ ｉ Ｅ ｔ Ｅ ｉＩ ｐ ｃ ｏ ｄ ａ ｔ ｅ ｒａ， ｉ ｉ ３０ ６ ， ｈｎ； ． ａ ｉ Ｕ ｉ ｒ ｔ ｏ ｃｅ ｅ ｎｎ ｙ ｔｎ ｉ ａ Ｑ ａｉ Ｂ ｎｎ Ｔ ｎｎ ｖ ｉ ｎ
单核细胞增生李斯 特氏菌 （ｉｅｉ ｍ ｎｃｔ ｅｅ ） Ｌｓ ｒ ｏ ｏｙｏ ｎｓ ｔａ ｇ （ ．ｏ ） Ｌｔ ． 简称单增李斯特 氏菌 ， ｏ 是一种重要 的人兽共 患
及畜牧业 的生产带 来严重 的威胁 ， 以建 立快速 准确 所 的检测 方法是 保证食 品卫 生安全 和有 效 防治本 病 的
摘 要： 建立单增 李斯特 氏菌的快速检测方法。 针对单增李斯特氏菌 ｖｒ ｉＲ基 因序列设计特异性 引物及探针 ， 建立等
温扩 增法 ， 并利用免疫金标 试纸条对 结果进行检测 。 １ 单增李斯特氏茵 、 用 ０株 ６株李斯特菌属菌株及其他食源性致
胶体金试纸快速检测食品中单增李斯特菌
胶体金试纸快速检测食品中单增李斯特菌
崔焕忠;张辉;王兴龙
【期刊名称】《食品科学》
【年(卷),期】2010(031)004
【摘要】制备单增李斯特菌(Lm)特异性单克隆抗体,研制胶体金试纸,快速检测食品中Lm.所研制的胶体金试纸具有较高的特异性,不与绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌同属菌及大肠杆菌、沙门氏菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌异属菌发生交叉反应;对Lm纯培养物检测的灵敏度为3.9×10~5 CFU/mL;4℃保质期在120d 以上;对自来水、牛奶、生肉制品、蔬菜、冷冻虾仁和面包模拟样品检测的灵敏度为3.9×10~5 CFu/mL.该试纸具有快速、敏感、特异的优点,可用于食品中Lm的快速检测.
【总页数】4页(P239-242)
【作者】崔焕忠;张辉;王兴龙
【作者单位】吉林农业大学动物科技学院,吉林,长春,130118;吉林农业大学动物科技学院,吉林,长春,130118;军事医学科学院军事兽医研究所,吉林,长春,130062【正文语种】中文
【中图分类】R446.62
【相关文献】
1.胶体金试纸条快速检测食品中磺胺二甲基嘧啶残留 [J], 林晓丽;饶辉;熊勇华;陈媛;刘文娟;赖卫华
2.胶体金免疫层析试纸条法快速检测动物性食品中的氨苯砜 [J], 赵兴然;郑小娇;沙芳芳;王敬;蔡亚鹏;王向红
3.冷鲜猪肉中单增李斯特菌快速检测试纸条的初步研制 [J], 赵鑫;张帅;祁文婧;齐颖颖;张红星
4.胶体金试纸条快速检测动物源性食品中头孢氨苄残留 [J], 刘敏轩;赵兴然;于璐;鹿浩志;王向红
5.单增李斯特菌免疫胶体金试纸条快速检测 [J], 熊国华;于莉;曹际娟;曹远银;王静因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
单核细胞增生性李斯特菌快速检测技术研究
单核细胞增生性李斯特菌快速检测技术研究单核细胞增生性李斯特菌快速检测技术研究引言：单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种潜伏在食品中常见的致病菌，能引起严重的食物中毒，威胁着人类的健康与生命安全。
因此，研究和发展一种快速、高效的检测技术对于食品安全至关重要。
本文旨在探讨目前关于单核细胞增生性李斯特菌快速检测技术的研究进展，并为进一步的研究和应用提供参考。
一、单核细胞增生性李斯特菌简介单核细胞增生性李斯特菌是一种革兰氏阳性菌，能在广泛的温度（0-45℃）和pH（4.4-9.6）范围内生长，且具有金属抗药性。
在食品中，该菌可以通过肉类、蔬菜和奶制品等途径传播，使其成为食品安全的重要隐患之一。
由于该菌对常规的煮沸和加热处理具有一定的抵抗能力，因此需借助有效的检测技术对其进行快速、准确的检测。
二、传统检测方法的局限性目前常用的单核细胞增生性李斯特菌检测方法主要包括传统培养方法、蛋白酶结合效应（ELISA）和分子生物学方法等。
然而，这些方法存在着以下局限性：1. 传统培养方法耗时长，需要较长的培养时间才能获得结果，无法快速检测；2. ELISA方法虽然具有较高的灵敏度和特异性，但其需要复杂的样品处理和实验步骤，使得检测过程繁琐；3. 分子生物学方法虽然能够提供较快的检测结果，但其仪器成本高，技术要求较高，限制了其在实际应用中的推广。
三、快速检测技术的研究进展随着科学技术的发展，研究人员不断探索和开发更为快速、准确的单核细胞增生性李斯特菌检测技术。
以下是几种常见的快速检测技术：1. 荧光定量聚合酶链反应（qPCR）技术：该技术以其高效、精确和快速的特点，被广泛应用于单核细胞增生性李斯特菌的检测。
qPCR技术可以快速扩增和定量样品中的特定基因片段，结合荧光定量技术实现李斯特菌的快速检测和定量。
2. 微生物芯片技术：微生物芯片是基于生物芯片技术的一种新型检测平台，可实现对多种菌种的快速识别和检测。
利用胶体金免疫层析技术快速定量检测单增李斯特菌方法的建立
1:3.5 × 108 cfu/ml；2:3.5 × 107 cfu/ml；3:3.5 × 106 cfu/ml；4:3.5 × 105 cfu/ml；5:3.5 × 104 cfu/ml；6:3.5 × 103 cfu/ml；7:3.5 × 102 cfu/ml； 8:3.5 × 101 cfu/ml；9：空白对照
1.7.1 定 性 检 测 将 处 理 后 的 样 品 和 样 品 处 理 液 （作为阴性样品）100 μl 加到制备好的胶体金免疫层 析试纸条样品垫端，静置 10 min。 检测带（T）和质控 带 （C）均 出 现 红 色 判 为 阳 性 ， 仅 质 控 带 出 现 红 色 为 阴 性，检测带和质控带均不显色，则为试纸条失效。 1.7.2 定量检测
中国国境卫生检疫杂志 2010 年 4 月第 33 卷第 2 期 Chinese Frontier Health Quarantine Apr.2010,Vol 33,No.2
· 127 ·
（2） 单 增 李 斯 特 菌 P60 多 克 隆 抗 体 （Listeria monocytogenes, multiple cloning antibody of P60 由 吉 林出入境检验检疫局提供）、羊抗兔 IgG（志 2010 年 4 月第 33 卷第 2 期 Chinese Frontier Health Quarantine Apr.2010,Vol 33,No.2
〔检测技术〕
利用胶体金免疫层析技术快速定量检测 单增李斯特菌方法的建立
谢士嘉 1 王 静 1 王振国 2 （1.中国检验检疫科学研究院，北京 100123；2.吉林出入境检验检疫局，长春 130062）
quantitativedetection单核细胞增生李斯特菌isteriamonocytogenes单增李斯特菌是李斯特菌属isteria中最重要的人类食源性病原菌也是一种人畜共患的致病菌它可引起人和动物患脑膜炎脑炎败血症心内膜炎流产死胎及脓肿等死亡率可达34年来已有不少国家报道了由于污染单增李斯特菌发生的食物中毒事件因此世界各国政府部门对单增李斯特菌引起的食物中毒事件越来越重视目前单增李斯特菌的检测主要依靠传统的分离培养和生化鉴定费时费力45年代以来发展起来的一项新型体外诊断技术近年来该方法发展迅速在生物医学领域特别是医学检验中得到了广泛应用但较少用于食品卫生领域
冷鲜猪肉中单增李斯特菌快速检测试纸条的初步研制
冷鲜猪肉中单增李斯特菌快速检测试纸条的初步研制赵鑫;张帅;祁文婧;齐颖颖;张红星【摘要】[目的]建立一种可快速检测单增李斯特菌的胶体金试纸条的制备方法.[方法]用自制的单核增生性李斯特菌作为抗原对BALB/c小鼠进行免疫,之后通过杂交瘤技术进行细胞融合制备出特异性良好的单克隆抗体,并通过双抗夹心ELISA体系筛选出2株稳定且配对最佳的抗体,利用胶体金免疫层析技术组装试纸条并分析其特性.[结果]筛选出的2株单抗命名为3B7、5C9,测得其灵敏度均为104 CFU/mL,抗体的最适pH值是8.0,最佳抗体标记是24 μg,试纸条的灵敏度为106 CFU/mL 且特异性良好.[结论]初步制备出可快速、准确检测冷鲜猪肉中单增李斯特菌的试纸条.【期刊名称】《北京农学院学报》【年(卷),期】2019(034)001【总页数】5页(P92-96)【关键词】单增李斯特菌;单克隆抗体;胶体金免疫层析试纸条【作者】赵鑫;张帅;祁文婧;齐颖颖;张红星【作者单位】北京农学院食品科学与工程学院/食品质量与安全北京实验室/北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心／微生态制剂关键技术开发北京市工程实验室,北京102206;北京农学院食品科学与工程学院/食品质量与安全北京实验室/北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心／微生态制剂关键技术开发北京市工程实验室,北京102206;北京农学院食品科学与工程学院/食品质量与安全北京实验室/北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心／微生态制剂关键技术开发北京市工程实验室,北京102206;北京农学院食品科学与工程学院/食品质量与安全北京实验室/北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心／微生态制剂关键技术开发北京市工程实验室,北京102206;北京农学院食品科学与工程学院/食品质量与安全北京实验室/北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心／微生态制剂关键技术开发北京市工程实验室,北京102206【正文语种】中文【中图分类】TS251.51单增李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)是革兰氏阳性菌，无芽孢和荚膜，具有很强的环境耐受力，在弱酸性、中性乃至弱碱性条件下皆可存活，其生长温度范围可达0～50℃，具有低温存活生长性，因此，单增李斯特菌是为数不多的低温致病菌之一[1,2]。
单增李斯特菌的快速检测方法研究进展
单增李斯特菌的快速检测方法研究进展作者：李波赵文胜王国柱冯冠吴文浩王丹丹来源：《现代农业科技》2016年第24期摘要单增李斯特菌是一种重要的人兽共患病病原体，其检测已成为食源性疾病预防与控制的重点内容。
单增李斯特菌快速检测技术的研究对我国食品安全工作具有极其重要的意义。
本文对国内外单增李斯特菌的多种快速检测方法及其检出限进行对比，探讨了快速检测单增李斯特菌在未来的发展方向。
关键词李斯特菌；快速检测；分子检测中图分类号 S852.6 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）24-0265-03Research Progress on Rapid Detection and Identification Methods for Listeria MonocytogenesLI Bo 1，2 ZHAO Wen-sheng 1 WANG Guo-zhu 1 FENG Guan 1 WU Wen-hao 1 WANG Dan-dan 1，2（1 Yanjiao Office of Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Yanjiao Hebei 065201； 2 Yanjiao Branch Center of Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau Inspection and Quarantine Technical Center）Abstract Listeria monocytogenes is a kind of facultative pathogens of human and animal，its detection and identification has become the focus of prevention and control of food borne diseases.In this paper，rapid detection methods and detection limit of Listeria monocytogenes at home and abroad were compared，and the future development direction of the rapid detection of Listeria monocytogenes was discussed.Key words Listeria monocytogenes；rapid detection；molecular detection单增李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种重要的人兽共患病病原体，也是一种最为常见的食源性病原菌，WHO将其列为20世纪90年代食品中四大致病菌之一。
食源性单核细胞增生李斯特菌快速检测研究进展
引用格式：林琦钰, 王丹庆, 马沁沁. 食源性单核细胞增生李斯特菌快速检测研究进展[J]. 中国测试，2023, 49(11): 68-75. LIN Qiyu, WANG Danqing, MA Qinqin. Research progress in rapid detection of food-borne Listeria monocytogenes [J]. China Measurement & Test, 2023, 49(11): 68-75. DOI: 10.11857/j.issn.1674-5124.2023080111食源性单核细胞增生李斯特菌快速检测研究进展林琦钰， 王丹庆， 马沁沁(四川师范大学生命科学学院，四川 成都 610101)摘 要: 食品安全是人类健康非常关注的问题，其中微生物污染是其主要的风险因素之一。
单核细胞增生李斯特菌是一种人畜共患病的病原体，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。
该菌广泛存在于自然环境中，低温条件下仍可生长繁殖，是威胁人类健康的主要病原菌之一。
传统细菌检测方法耗时长，不能满足现场检测的需求。
因此开发快速、准确、高效、可靠的单核细胞增生李斯特菌检测方法是目前研究的热点。
基于免疫学、分子生物学、生物传感器和噬菌体等技术的检测方法成为单核细胞增生李斯特菌检测的重要手段。
该文综述各类检测技术的研究进展，阐述各个方法在致病菌检测中的原理、特点、应用现状和发展，并讨论各方法的优缺点，以期为单核细胞增生李斯特菌检测新技术的研发提供参考。
关键词: 食品安全; 单核细胞增生李斯特菌; 快速检测中图分类号: TB9文献标志码: A文章编号: 1674–5124(2023)11–0068–08Research progress in rapid detection of food-borne Listeria monocytogenesLIN Qiyu, WANG Danqing, MA Qinqin(College of Life Sciences, Sichuan Normal University, Chengdu 610101, China)Abstract : Bacterial contamination is one of the major problems that is considered a serious health risk factor for food safety and human health. Listeria monocytogenes (LM) is a zoonotic pathogen that can cause a variety of clinical syndromes such as reason sepsis, meningitis, and monocytosis and is widely distributed in nature.Specifically, it can grow and reproduce at low temperatures, threatening the human health of raw foods.Conventional methods of LM detection are time-consuming and cannot meet the requirements for on-site detection. Therefore, there has been an increase in demand for the development of fast, accurate, efficient, and reliable detection methods for LM in recent years. Recent rapid detection methods have been developed based on immunology, molecular biology, biosensors, and bacteriophages. Herein, we summarize the principles,characteristics, and application of various rapid detection technologies for LM, and the advantages and disadvantages of these technologies were fully discussed. Hopefully, the review can provide a reference and offer a blueprint for the research and development of new technologies for detecting LM.Keywords : food safety; Listeria monocytogenes ; rapid detection收稿日期: 2023-08-24；收到修改稿日期: 2023-10-19基金项目: 国家自然科学基金（31800158）作者简介: 林琦钰（1998-），男，四川凉山彝族自治州人，硕士研究生，专业方向为资源与应用微生物学。
金标试纸法快速检验李斯特氏菌探讨
［ 摘
要】 章选用金标试纸法作为李斯特菌 的快速筛选方法 ，加快检验速度 ，方便 商品流通 ，用此方法对 ４ 文 Ｏ份进
Ｖ的鸡 肉、猪 肉、牛 肉及鱼类进行 了单增李斯特氏菌检测 ，并与国标 方法 、Ｓ Ｉ ” Ｎ方法 进 行比较 ，并参考 了食品微生 １
物 实 验 室工 作 指 南 ，得 出 的 结 果是 采 用 金 标 试 纸 法检 验 李 斯 特 菌 快 速 、 准 确 、 方便 。
3讨论一表6本试剂盒对不同浓度的增菌液的检验情况tab6examinmionbythiskitondifferentenrichmentfluidswithdifferentlevelsofconcentration接种量cfu?ml结果550500未接种李斯特氏菌1从表l3可以看出gb方法和sn方法检验操作复杂耗时长工作量大效率低且自炽光容易对眼造成疲劳增加人为误差易造成漏检而试剂盒可操作性强操作方便检验结果较直观且准确取6滴约l35此灭活后的二次增茵液加入李斯特检测条中1520min即可观察结果无需平板分离比传统方法缩短一半的时间筛选出李斯特茵阴性样品减轻工作量提高工作效率加快商品的流通
修 订 食 品 安全 法 规 时 把 单 核 细 胞 增 生 李 斯 特 氏 菌 纳 入 法 规 强
１ 实验 部 分
１１材 料 ．
１１１ 培 养基 ．．
Ｒ ｖａ ｅｅ ｌ李斯特 菌快速检 测试剂盒 购 自广州 市诺森 生物技 术有限公司（ ＡＣ认可） ＡＯ ，由美 国 ＮＥ ＯＧＥ 公司生产 ；牛津 Ｎ
［ 关键词】 李斯特氏菌 ；测试纸片 ；快速 ；准确 ；方便
［ 分 类 号１ ６ ２７ 中图 ０ ５． ［ 标 识 码 】 文献 Ａ ［ 编 号 ］ｏ ７１６ （０ ８０ ． １２０ 文章 １ｏ ．８ ５２ ０ ）９０ ．３ ３
胶体金快捷免疫诊断技巧
管会在其表面留下印痕.划痕容易对层析的金标复合物形成阻力,导 致假阳性。
干燥
■干燥方法的比较
37度干燥４h：颗粒感较强，易中间白，周边深; 低温真空干燥３h：颜色均一，只是两端稍浅，有一定的柔性。
试纸条组装
■ 在干燥间内准备好吸水滤纸、样品垫、PVC底板，在 PVC底板中央贴上包被好的硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜 上缘粘贴吸水滤纸，硝酸纤维素膜下缘粘贴胶体金垫，胶 体金垫下缘粘贴样品垫，完成后用裁切机将贴好的试纸板 切成4 mm宽的试纸条。再将试纸条密封于铝箔袋中，完 成产品的组装。
径粒(nm) 147 97.5 71.5 40 24.5 15
胶体金的鉴定
1. 肉眼观察：在日光下仔细观察胶体金颜色，可以大致估计 金颗粒大小。同时良好的胶体金应该是清澈透明的，若浑 浊或有漂浮物提示有较多的凝集颗粒。
2. 分光光度计扫描吸收峰时光波长来估计金颗粒的大小。
3. 电镜可见精确测定金颗粒的大小。
2. 用微孔滤膜或超速离心除去蛋白质溶液中的细小微粒。 3.胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或略 偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于 蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。
■ 蛋白质最适用量测定:
■ 将待标记的蛋白质（鼠抗人IgG）储存液作系列稀释后， 分别取0.1ml加到 1ml胶体金溶液中，另设一管不加蛋白质 的对照管，5分钟后加入0.1ml 10％NaCl溶液，混匀后静置 2小时。
单增李斯特菌免疫胶体金试纸条快速检测
作者单位:1 沈阳农业大学免疫研究所,沈阳110161;2 辽宁出入境检验检疫局;3 中国检验检疫科学研究院作者简介:熊国华(1980-),男,湖南常德人,硕士在读,研究方向:分子免疫学。
通讯作者:曹际娟文章编号:1001 0580(2008)02 0248 02 中图分类号:R 151.1 文献标志码:A检验技术单增李斯特菌免疫胶体金试纸条快速检测熊国华1,于莉1,曹际娟2,曹远银1,王静3单核细胞增生李斯特菌(L isteria monocytogenes,单增李斯特菌),是李斯特菌属(L isteria)中最重要的人类食源性病原菌!1∀。
目前单增李斯特菌的检测方法主要依靠传统的分离培养和生化鉴定,该方法费时费力!2,3∀。
胶体金快速诊断试纸条技术是20世纪90年代以来发展起来的一项新型体外诊断技术!4∀。
近年来该方法发展迅速,在生物医学领域特别是医学检验中得到了广泛应用,但用于食品卫生领域检测的产品较少。
本研究针对单增李斯特菌研制出了食品污染单增李斯特菌的免疫胶体金检测试纸条。
1 材料与方法1 1 材料 (1)菌株:单增李斯特菌5株;鼠疫菌、鼠伤寒沙门菌、大肠埃希菌O 157#H 7、假结核耶尔森菌、金黄色葡萄球菌、表面葡萄球菌、大肠埃希菌、弗氏柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌、葡萄球菌各1株(分别由军事医学科学院流行病研究所和中国检验检疫科学研究院卫检所提供)。
(2)试剂:脑心浸液(BHI)、营养琼脂(北京陆桥商检新技术公司)培养基;N C 膜(美国M illiplore 公司);玻璃纤维、吸水滤纸(北京华美公司);氯金酸(上海国药集团化学试剂有限公司);其余试剂(军事医学科学院药品器材供应站)。
(3)主要仪器:隔流喷金划线机(美国I magen Ar ista 公司);切膜机、压壳机、划线机(天津科矩公司);N D-1000超微量蛋白定量仪(美国N ano Drop 公司);超纯水发生器(美国M illipo re 公司);高速冷冻离心机(德国Eppendorf 公司)。
快速检测产单核李斯特菌免疫胶体金层析法的研究
[作者简介] 罗立新(1966-),男,博士,副教授,主要从事微生物制药研究。
【论著】快速检测产单核李斯特菌免疫胶体金层析法的研究罗立新1,缪 珑1,潘 力1,岳振峰2,谢丽琪2(11华南理工大学生物科学与工程学院,广州 510640;21深圳出入境检验检疫局进出口食品检测中心,广东深圳 518067)[摘要] 目的:为产单核李斯特菌提供了一个方便快捷切实有效的检测技术。
方法:采用胶体金标记产单核李斯特菌抗体制备免疫层析检测试剂,通过免疫层析作用对产单核李斯特菌进行检测。
结果:通过选用柠檬酸钠改良法制备胶体金,测定其最适结合蛋白浓度为28μg/m l,构建起免疫层析检测试剂和检测方法,检测了冷冻猪肉、牛奶、冰激凌以及不同稀释度的产单核李斯特菌标准样品,灵敏度达8715%,具有良好的重现性。
结论:免疫胶体金层析法用于快速检测产单核李斯特菌是可行的。
[关键词] 产单核李斯特菌;胶体金;免疫层析[中图分类号] R378199+4 [文献标识码] A [文章编号] 1004-8685(2006)02-0154-03Gold i m m unochro ma to -graphy a ss ay for detecti on of L iste ria m onocytogenesL uo L i 2xin 1,M iao L ong 1,Pan L i 1,Yue Zhen 2feng 2,X ie L i 2qi2(11College of B i oscience and Technol ogy,South China University of Technol ogy,Guangzhou 510640,China;21I ns pecti on Center of I m port &Export Food,Shenzhen Entry -Exit I ns pecti on &Quarantine Bureau,Shenzhen 518067,China )[Abstract] O bjevti ve:To creat a convenient,quick,effective method f or detecting L isteria m onocytogenes .M ethods:Coll oidal gold was coup led with the antibody against L isteria m onocytogenes and L isteria m onocytogenes was detected by i m munochr omat o graphy assay in this study 1Results:Coll oidal gold was p repared by citrate -natriu m i m p r oved method and the best compatible p r o 2tein concentrati on was measured as 28μg/m l,therefore,gold i m munochr omat o graphy assay for detecti on was f ounded 1The de 2tective sensati on was 8715%and the detecti on can be very recurred by detecting refrigerant pork,m ilk,ice cream and s ome sa m 2p les of L isteria m onocytogenes with diverse diluti on rate 1Conclusi on:The detecti on method possesses the better feasibility and is a convenient,quick,effective technol ogy f or L isteria m onocytogenes 1[Key words] L isteria m onocytogenes ;Coll oidal gold;Gold i m munochr omat o graphy 产单核李斯特菌(L isteria m onocytogenes ,Lm )是一种短小的革兰阳性无芽胞杆菌,是一种人畜共患病的致病菌,可使人和动物患李斯特菌病。
单增李斯特菌便捷检测试纸的制备及检测效果
单增李斯特菌便捷检测试纸的制备及检测效果郑晓风;韩勇;刘英玉;张军涛;张琦;张晓红;姚刚【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2016(037)020【摘要】目的：研究一种快速、便捷检测食品中单增李斯特菌的方法，拟对本实验室制备的单增李斯特菌快速检测试纸（Listeria monocytogenes-fast test paper，LM-FTP）（专利受理号：201510274726.9）进行检测效果评价。
方法：采集肉样、乳样、水样和蔬菜，用LM-FTP进行检测，并与市售单增李斯特菌检测试纸片（3M PetrifilmTM）进行比对实验。
结果：LM-FTP的检测特异性为100%，检测限为2.1×104CFU/mL。
增菌培养到报告结果只需5.5 h。
LM-FTP和3M PetrifilmTM检测都可对样品完成检测，对农贸市场畜产品及蔬菜检测，二者符合率为75%，对超市同类食品检测，二者符合率为62.5%；对超市熟食检测时，二者符合率为93.75%。
结论：与市售3M PetriiflmTM检测方法相比，LM-FTP检测试纸制备简单，操作便捷，较3M PetrifilmTM的24 h报告结果更节省时间，但在检测灵敏度方面有一定差距，尚需进一步研究改进。
【总页数】7页(P191-197)【作者】郑晓风;韩勇;刘英玉;张军涛;张琦;张晓红;姚刚【作者单位】新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052;新疆乌鲁木齐市畜牧草原工作站，新疆乌鲁木齐 830000;新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052;新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052;新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052;新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052;新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052【正文语种】中文【中图分类】S852.612【相关文献】1.胶体金试纸快速检测食品中单增李斯特菌 [J], 崔焕忠;张辉;王兴龙2.鸡单增李斯特菌全菌灭活苗的制备与效果检测 [J], 万亮;黄专;余连喜;易艳芳;赵星;杨玉莹3.环介导等温扩增技术与横向流动试纸条法快速检测单增李斯特菌的研究 [J], 李秀梅;梁智选;李颖;郭恋;王虹;关建军;王红军4.冷鲜猪肉中单增李斯特菌快速检测试纸条的初步研制 [J], 赵鑫;张帅;祁文婧;齐颖颖;张红星5.单增李斯特菌免疫胶体金试纸条快速检测 [J], 熊国华;于莉;曹际娟;曹远银;王静因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
作者单位:1 沈阳农业大学免疫研究所,沈阳110161;2 辽宁出入境检验检疫局;3 中国检验检疫科学研究院作者简介:熊国华(1980-),男,湖南常德人,硕士在读,研究方向:分子免疫学。
通讯作者:曹际娟文章编号:1001 0580(2008)02 0248 02 中图分类号:R 151.1 文献标志码:A检验技术单增李斯特菌免疫胶体金试纸条快速检测熊国华1,于莉1,曹际娟2,曹远银1,王静3单核细胞增生李斯特菌(L isteria monocytogenes,单增李斯特菌),是李斯特菌属(L isteria)中最重要的人类食源性病原菌!1∀。
目前单增李斯特菌的检测方法主要依靠传统的分离培养和生化鉴定,该方法费时费力!2,3∀。
胶体金快速诊断试纸条技术是20世纪90年代以来发展起来的一项新型体外诊断技术!4∀。
近年来该方法发展迅速,在生物医学领域特别是医学检验中得到了广泛应用,但用于食品卫生领域检测的产品较少。
本研究针对单增李斯特菌研制出了食品污染单增李斯特菌的免疫胶体金检测试纸条。
1 材料与方法1 1 材料 (1)菌株:单增李斯特菌5株;鼠疫菌、鼠伤寒沙门菌、大肠埃希菌O 157#H 7、假结核耶尔森菌、金黄色葡萄球菌、表面葡萄球菌、大肠埃希菌、弗氏柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌、葡萄球菌各1株(分别由军事医学科学院流行病研究所和中国检验检疫科学研究院卫检所提供)。
(2)试剂:脑心浸液(BHI)、营养琼脂(北京陆桥商检新技术公司)培养基;N C 膜(美国M illiplore 公司);玻璃纤维、吸水滤纸(北京华美公司);氯金酸(上海国药集团化学试剂有限公司);其余试剂(军事医学科学院药品器材供应站)。
(3)主要仪器:隔流喷金划线机(美国I magen Ar ista 公司);切膜机、压壳机、划线机(天津科矩公司);N D-1000超微量蛋白定量仪(美国N ano Drop 公司);超纯水发生器(美国M illipo re 公司);高速冷冻离心机(德国Eppendorf 公司)。
12 方法1 2 1 单增李斯特菌抗体与胶体金制备 单增李斯特菌多克隆抗体为本实验室制备。
采用柠檬酸钠还原法!5∀制备25nm 的胶体金。
1 2 2 胶体金标记抗体最佳条件测定 (1)最佳pH 值:采用文献!6∀方法。
(2)最佳标金量:采用试管观察法!7∀。
1 2 3 胶体金探针的制备 采用文献!8,9∀方法。
1 2 4 抗体最佳包被浓度和封闭浓度确定 用0 01mol/L 的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH 7 2)把单增李斯特菌抗体稀释为4 0,3 0,2 0,1 5,1 0,0 5mg /ml 的抗体,而且每个浓度的抗体均含有2 0%,1 5%,1 0%,0 75%,0 5%小牛血清(BSA)的各1管。
取稀释好的单增李斯特菌抗体(T 带)和羊抗兔抗体(C 带)用隔流喷金划线机在NC 膜上划线,置于37∃干燥2h 。
然后进行检测。
1 2 5 胶体金试纸条的组装和检测结果判读 胶体金试纸条由样品垫、胶金垫、NC 膜和吸收垫4部分组成。
将其组装好后用切条机切割成4mm/条后进行检测。
加样10min 后,检测带和质控带均出现红色的为阳性,只有质控带出现红色的为阴性,检测带和质控带均不显色则试纸条无效。
1 2 6 胶体金试纸条性能试验 (1)敏感性试验:脑心浸液(BHI)培养基37∃培养18h 的单增李斯特菌,4∃8000r/min 离心10min,再以PBS 稀释成不同数量级的菌悬液,涂布血平板进行菌落记数,同时进行检测。
(2)试纸条的特异性试验:单增李斯特菌用BHI 培养基培养,其余菌株用溶菌肉汤(LB)培养基培养,4∃8000r/min 离心10min,再用含1%土温20(T w een-20)的PBS 样品稀释液制成菌悬液进行检测。
(3)试纸条的稳定性试验:将胶体金免疫层析试纸条于37∃存放,并分别在3,4,5,6,7d 时取单增李斯特菌悬液(浓度为106CFU /ml)、小牛血清(浓度为1mg /ml)和金黄色葡萄球菌(浓度为109CFU /ml)进行检测,并与同样的P BS 溶液做为样品空白对照。
1 2 7 检测模拟污染样品 火腿肠50mg 、奶粉50mg 、牛奶250 l 和人血清100 l,分别加入到1ml 含单增李斯特菌的样品稀释液中,混匀,静置10min 或短暂离心(8000r/mi n 离心15s),再取1份培养后的菌液,用PBS 10倍系列稀释进行检测。
2 结 果2 1 胶体金标记抗体最佳条件2 1 1 pH 值 pH %7 5各管中溶液颜色呈不同程度的蓝色,pH &7 5,各管中溶液颜色无变化,离心后pH %8 0的标记管中沉淀不能完全溶解,pH &8 5的标记管中沉淀完全溶解,溶液呈透明紫红色。
因此,胶体金标记的最佳p H 值为8 5。
2 1 2 最佳标金量 静置后观察,含抗体量少的管呈现出由红变蓝的聚沉现象,而加入抗体达到或超过最低稳定量的试管中的溶液则保持红色不变。
使红色保持不变的抗体含量最低的试管的抗体量就是抗体的最适保护量,在此基础上增加20%为稳定胶体金的抗体最佳标金量。
当抗体加入量低于12 g/ml 的各管颜色均变蓝,都发生了不同程度的聚沉。
所以抗体的最佳标金量为15 g /ml 。
2 2 抗体最佳包被浓度和封闭浓度 用不同浓度的单增李斯特菌的菌悬液检测不同包被浓度和封闭浓度的试纸条。
结果可见,能检出106CF U /ml 单增李斯特菌的最低包被浓度为1 0mg /ml,BSA 最高封闭浓度为2 0%。
空白对照结果显示,包被浓度过高和封闭浓度过低会产生假阳性。
所以,考虑到储存和运输对试纸条的影响,选定最佳包被浓度为2 0mg/ml,封闭浓度为1 0%。
2 3 敏感性试验(图1) 优化检测带、质控带抗体浓度和胶体金探针浓度以及层析条的层析特性后,从1 0∋109CFU /ml 单增李斯特菌样本10倍系列稀释,不含单增李斯特菌的样品液为空白对照。
结果可见,免疫层析条检测灵敏度为1 0∋106CF U /ml 。
2 4 特异性试验(图2) 以样品稀释液同样分别处理金黄色葡萄球菌,大肠埃希菌O 157:H7、鼠伤寒沙门菌,阴沟肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、表面葡萄球菌、鼠疫菌、假结核耶尔森菌至1∋107CFU /ml,以制备好的胶体金免疫层析试纸条检测,并与同样菌数的单增李斯特菌样品对照,同时检测空白对照。
结果可见,该检测试纸条对于这些球菌或杆菌均无非特异现象出现。
注:1~4:为单增李斯特菌,其中1:1 0∋105CFU/ml;2:1 0∋106CFU/ml;3:1 0∋107CFU/ml;4:1 0∋108CFU/ml;5:空白对照。
图1 试纸条敏感性检测注:1:空白对照;2:金黄色葡萄球菌;3:大肠埃希菌;4:大肠埃希菌O157:H7;5:鼠伤寒沙门菌;6:阴沟肠杆菌;7:弗氏柠檬酸杆菌;8:表面葡萄球菌;9:鼠疫菌;10:假结核耶尔森菌;11:单增李斯特菌。
图2 试纸条特异性检测2 5 稳定性试验(图3) 取在37∃放置的单增李斯特菌胶体金检测试纸条进行检测,第7d的检测结果可见单增李斯特菌测试条的稳定性良好,在37∃放置7d后仍能特异性的检出单增李斯特菌,而且敏感性也未下降。
注:1:1%BSA;2:金黄色葡萄球菌108CFU/ml;3:单增李斯特菌106CFU/ml;4:空白对照。
图3 试纸条稳定性检测2 6 模拟污染样品试验 试纸条检测模拟污染样品试验的结果表明,该试纸条检测食品中模拟污染的单增李斯特菌仍然能检测到106CFU/ml,而血清由于其组分和粘稠度等的原因对检测的灵敏性有一定的影响,但还能检测到107CFU/ml。
3 讨 论单增李斯特菌在美国被列为7种主要的食源性致死病菌之一!10∀,WHO食品安全工作计划已将其列为重点检测的食源性病菌之一!11,12∀。
我国2008年即将迎来的奥运会并将大量消耗牛奶等即食食品,而这些即食食品很容易被单增李斯特菌污染,这就要求及时对即食食品批量的快速检测。
本研制适用于现场快速检测的双抗体夹心胶体金免疫层析试纸条。
该试纸条的标记物和被标记抗体通过静电引力和疏水作用结合,因而不会影响抗体活性!11,12∀。
胶体金本身具有肉眼可见的颜色,无需仪器即可判读结果。
无需洗涤,不形成免疫复合物的标记抗体通过层析作用自动分离,既简化了操作步骤,又减少了影响实验结果的干扰因素!11∀。
该法通常能在5 ~10min完成检测,样品处理方法简便、操作灵活、运输方便、不需要其他辅助仪器,结果可直观判断,而且试纸条自带质量控制线,实验结果一目了然,为现场检测提供最佳检测法,尤其是对被单增李斯特菌污染的即食食品的检测,具有简便、快速、特异、敏感、稳定等特点,有利于对单增李斯特菌引起食物中毒的及时诊断。
因此,该试纸条具有广阔应用前景。
(感谢军事医学科学院微生物流行病研究所姜永强老师在实验上给予的指导和帮助)参考文献!1∀ Yundong Chi-Zhang,Ki t L Yam.Effective control of Listeri a monocytogenes by combination of nisin formulated and slow ly released into a broth system[J].International Journal of Food M icrobiology,2004,90:15-22.!2∀ 吴清平,李善志,张菊梅,等.单核细胞增生李斯特菌检测技术研究进展[J].中国卫生检验杂志,2005,15(7):888-890.!3∀ Robin L T Churchill,Hung Lee,et al.Detection of Listeria mono cytogenes and the toxin listeriol ysin O in food[J].Journal of M icrobiological M ethods,2006,64:141-170.!4∀ 李永勤,杨瑞馥.以膜为固相载体的免疫胶体金快速试验[J].微生物学免疫学进展,2003,31(1):74-78.!5∀ Zhu L,Chen X.Experimental methods of immunology[M].Public of Army Press,2000:99-110.!6∀ 杨书豪,张云汉,王玉金,等.血清甲胎蛋白胶体金免疫层析快速检测法的建立及应用[J].实用肿瘤杂志,2003,19(1):48-51.!7∀ 严杰,罗海波,陆德源.现代微生物学实验技术及其应用[M].北京:人民卫生出版社,1997:222-223.!8∀ 金冬雁,黎孟枫(译).分子克隆实验指南[M].北京:北京科学技术出版社,1996:858-859.!9∀ 宋农,李君文,王新为,等.胶体金免疫层析法用于产肠毒素葡萄球菌快速检测的研究[J].中华检验医学杂志,2003,26(7):443-444.!10∀ 李干红,丁晓雯.李斯特菌及其快速检测[J].广州食品工业科技,2002,18(3):67-69.!11∀ 周晓辉,焦新安.产单核细胞李斯特菌的分子鉴定与亚分型研究[J].中国人兽共患病杂志,2003,19(5):44-47.!12∀ 魏建忠,李郁,焦新安,等.应用PCR技术快速检测市售猪肉中产单核李斯特菌[J].中国卫生检验杂志,2006,16(4):422-423.收稿日期:2007 06 11(孔繁学编辑 刘铁校对)。