革兰染色与抗酸染色操作规范

一、实验原理

G＋菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上，呈紫色。

G－菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高，乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄或稀释石碳酸复红复染后呈红色。

二、实验器材

【载玻片、试管架、红蓝铅笔、接种环、记号笔、酒精灯、打火机、生理盐水、吸水纸、冲洗瓶】、钟表、显微镜、香柏油、擦镜纸、染色盘、染色架、消毒洗手液等。三、实验试剂

革兰染液：草酸铵结晶紫染液、碘液、脱色液（95%乙醇）、蕃红复染液。

四、实验标本

痰液

五、操作步骤

1.标记选择玻片并正确编号（标本号）

2.涂片用灭菌接种环挑取菌落与载玻片上预先滴加的生理盐水涂布成1cm2或蚕豆大小的半透明菌膜。

3.干燥涂片制成后，在空气中使其迅速干燥，以免菌体皱缩变形（若需加快干燥速度，将涂布面朝上，置于火焰上方，不烫手的位置，慢慢烘干，切勿紧贴火焰）。

4.固定玻片干燥后火焰加热法固定，即玻片（菌膜面向上）中速从火焰上端通过3次进行固定，以玻片反面接触手背皮肤，热而不烫为宜。

5.初染加结晶紫染液染60s，细流水冲洗，并倒去玻片上积水。

6.媒染加碘液染60s，细流水冲洗。

7.脱色加脱色液，不时摇动10s~30s，至无紫色逸出为止，细流水冲洗。

8.复染加复染液，染30s~60s，细流水冲洗。

9.镜检待已染色的细菌标本片自然干燥或用吸水纸吸干后，再用显微镜进行观察，先用低倍镜观察，再滴加一滴香柏油用油镜观察。

注意：染色时间不同试剂有所不同。

六、结果观察

1、紫色：G+

2、红色：G-

一、实验原理：

分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色。

抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为蓝色。

二、实验器材

【载玻片、试管架、红蓝铅笔、接种环、记号笔、酒精灯、打火机、吸水纸、冲洗瓶】、钟表、显微镜、香柏油、擦镜纸、染色盘、染色架、消毒洗手液等。

三、实验试剂

1、石炭酸复红：碱性复红酒精饱和溶液10mL+5%石炭酸90mL

2、3%盐酸酒精：浓盐酸3mL+95%酒精97mL

3、吕氏美兰液：美兰酒精饱和液30mL+氢氧化钾(1:10000) 100mL

四、实验标本

痰液

五、操作步骤

1.标记选择玻片并正确编号（标本号）

2.涂片用接种环直接挑取标本中脓性或干酪样部分痰，制成10 mm×20 mm大小的均匀薄涂片，或多次薄涂制成厚涂片。

3.干燥涂片制成后，在空气中使其迅速干燥，以免菌体皱缩变形（若需加快干燥速度，将涂布面朝上，置于火焰上方，不烫手的位置，慢慢烘干，切勿紧贴火焰）。

4.固定玻片干燥后火焰加热法固定，即玻片（菌膜面向上）中速从火焰上端通过3

次进行固定，以玻片反面接触手背皮肤，热而不烫为宜。

5.初染用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，加热3-5分钟，待标本冷却后用水冲洗。

6.脱色3%盐酸酒精脱色30秒~1分钟;用水冲洗。

7.复染用碱性美兰溶液复染1分钟，水洗。

9.镜检待已染色的涂片标本片自然干燥或用吸水纸吸干后，再用显微镜进行观察，先用低倍镜观察，再滴加一滴香柏油用油镜观察。

六、结果观察

淡蓝的背景下可见染成红色的细长或略带弯曲的杆菌，有分枝生长趋向，此即为抗酸阳性杆菌，其他细菌或细胞被染成蓝色，根据各实验室的标准报告：- ，±，+，++，+++，++++。

镜检结果报告方法

连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌抗酸杆菌阴性（-）在300个视野里发现1-8条抗酸杆菌抗酸杆菌阳性（报告实数抗酸杆菌数）在100个视野里发现抗酸杆菌3-9条抗酸杆菌阳性（+）

在10个视野里发现1-9条抗酸杆菌抗酸杆菌阳性（++）

在每个视野里发现1-9抗酸杆菌抗酸杆菌阳性（+++）在每个视野里发现10条或10条以上抗酸杆菌阳性（++++）