霍乱弧菌的分离与鉴定.总结
1株O139群霍乱弧菌的分离鉴定
３４ ０ １５０；２ ．嘉兴市疾病预 防控制 中心
桐乡
毒素共调菌毛 Ａ （ ｐ ）４种毒力基 因均为 阳性 ， ｔＡ ｃ 说 明该菌株为产毒株。
・
９ ・ ６ Biblioteka 浙江预防医学 ２ １ ０ １年第 ２ ３卷第 １ 期 １
Ｚ ｅ ａｇＰｅｅｔｅＭｅｉｉ ，Ｎ ｖ ０ １ ｏ ２ ，Ｎ ． １ ｈｉ ｎ ｒ ｎｉ ｄｃ ｅ ｏ．２ １ ，Ｖ ｌ ３ ｏ１ ｉ ｖ ｖ ｎ
（２ ｔ ） 各 ０ ｘ ｍ ０５ ｌ Ｔｑ 酶 ． ， ａ （５ ／ １ Ｕ ｉ ） ｚ ０５ ｌ ． ，模板 ２ ｌ ，双蒸 水 １．５ １ （ ） Ｐ Ｒ ２７ 。 ３ Ｃ 扩增 程 序为 ：９ ４℃ 预 变 性 ５ｍｎ ｉ，然 后 以 ９ ４℃ １ ｍｉ，５ ｎ ５℃ ｌｍｉ ２℃ １ｍｉ 增 ３ ｎ，７ ｎ扩 ０个 循 环 ， 最后 ７ ｃ扩 增 ７ ｍｎ ２ｃ ｉ。取 扩 增 产 物 ５ ｌ ，加 入
材料与方法
１ 样 品来源 标本 。 桐乡市 医院肠道 门诊监测病例粪便
供。以上培养基均在有效期内。诊断血清 ：霍乱弧
菌 Ｏ１多价 和 ０ ３ 断 血 清购 自中 国药 品生 物 制 １９诊
２ 方法 （ ）霍乱弧菌培养、血清学鉴定均按 １ 《 ８－ ２０ 霍乱诊断标准》进行。从 ３ ＷＳ２９ ０８ ７℃培 养 １ — ４ｈ ８ ２ ４号琼脂平板上挑取单个菌落 ，接种于 弧菌生化 编 码鉴 定 管 ，３ ７℃ 培 养 ２ ４ ｈ后 判 读。 （ ） 毒力 基 因检 测 ：从 ４号 琼脂 平 板 上 刮 取 单 个 ２ 菌落到 ｌｍ 双蒸水中混匀 ，１００ｒｍ离心 １ｍｎ ｌ ００ ｐ ｉ，
霍乱弧菌实验室检验技术
一、霍乱概述 二、霍乱病原学 三、霍乱弧菌常规检验 四、霍乱弧菌的快速诊断 五、霍乱弧菌的噬菌体-生物分型 六、霍乱菌株的管理、保存与上送
2024/1/3
一、霍乱概述
霍乱是由01群和0139群霍乱弧菌 （V．cholerae）引起的急性肠道传染 病，发病急、传播速度快、波及范 围广、危害严重的甲类传染病。
2024/1/3
必须注意同一样品中O1、O139群霍乱弧 菌可能同时存在，有必要对所有选出的 菌落都进行凝集试验。
提倡所选菌落先经纯培养后再作相关鉴 定，除非情况特殊，一般不提倡直接使 用疑似菌落作玻片凝集。尤其对于TCBS.
如从分离培养基上直接挑取单个菌落进 行血清凝集试验，可能会有假阴性或假 阳性的出现，应谨慎判断结果，特别是 外环境样品。
挑取可疑菌落作玻片凝集
– 与O1群多价和单价血清作玻片凝集反应 – 与O139群抗血清做凝集反应
2024/1/3
血清鉴定：自分离培养基上挑取可疑菌 落与01群霍乱弧菌多价/单价诊断血清及 0139群霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集试 验。玻片凝集用血清的效价一般应为 1∶40～1∶50。如可疑菌落在血清中很 快(一般在10s内)出现肉眼可见的明显凝 集，在生理盐水中不凝集者判为阳性。 可疑菌落较多时，应挑选5个以上的菌落 逐个进行玻片凝集检查，必要时，取原 划线菌落边缘透明部分再做玻片凝集， 均为阴性时方可报告未检出01群及0139 群霍乱弧菌。对首发病例菌株需送上一 级实验室做进一步鉴定或复查。
强调在选择培养上发现疑似菌后，首先 考虑进行01/0139群霍乱弧菌的玻片凝集 试验。必须从平板上各挑取5个以上的 （少于5个的全部挑取）疑似菌落进行 01/0139群霍乱弧菌玻片凝集试验。
不同类型的平板上，菌落形态有不同的 特征-----选择你最有把握的。
霍乱弧菌
二、幽门螺杆菌
3、诊断： ①侵入性：取胃黏膜标本，首选尿素酶试 验（强阳性，*尿素→NH3＋*CO2）；病原菌分 离培养；组织染色镜检。 ②非侵入性：尿素14C呼气试验，为根除判 断之首选。 4、治疗：三联疗法即质子泵抑制剂（奥美 拉唑）＋2种抗生素（阿莫西林、克拉霉素或替 /甲硝唑）联用，疗程7～14天。4周后复查。
霍乱弧菌
3. Each of the following statements concerning the pathogen（病原体）is correct EXCEPT A. It is a gram-negative bacterium B. It grows best at a very high pH（8.8-9.0） C. It is actively motile by means of a polar flagellum（鞭毛） D. It is spread by contaminated water and food E. It can induce an invasive infection
霍乱弧菌
2．The microbial responsible for the patients’s diarrhea is a toxin（毒素）that A．Blocks EF-2 and inhibits protein synthesis B．Yields increased intracellular levels of cAMP C．Yields increased intracellular levels of cGMP D．Inbibits the release of acetylcholine（乙酰胆 碱）at the synapse（突触） E. Stimulates neural receptors
传染病学指导：霍乱的实验室检查
霍乱常⽤的实验室检查有：
（1）直接镜检：
①直接涂⽚染⾊：将标本涂⽚，固定后⽤1∶10稀释⽯炭酸复红染⾊和⾰兰⽒染⾊，镜检有⽆典型弧菌。
典型霍乱弧菌互相连接平⾏排列，有如“鱼群”。
②悬滴标本：将标本制成悬滴，镜检细菌动⼒，⽤暗视野显微镜。
霍乱弧菌运动活泼，呈⼩鱼穿梭状。
（2）分离培养：将吐泻物直接或先经碱性胨⽔增菌后，接种于庆⼤霉素琼脂等培养基，容易检出霍乱弧菌。
应⽤荧光抗体检测粪便中霍乱弧菌，可于1～2⼩时内获得结果。
（3）⾎清学检查：可作⾎清凝集试验。
在发病第1～3⽇及第10～15⽇各取1份⾎清，若第2份⾎清的抗体效价⽐第1份增⾼4倍或4倍以上，有诊断参考价值。
（4）制动试验——快速诊断：在急性病⼈的⽔样便中含有⼤量弧菌，如悬滴检查阳性，再滴加不含防腐剂的霍乱多价⾎清（使⽤浓度为1∶64），⼏分钟内细菌运动停⽌，凝集成块即为阳性。
若具备下列条件之⼀者，可确诊为霍乱：
①凡有腹泻、呕吐等症状，⼤便培养霍乱弧菌阳性者；
②霍乱流⾏期间，在疫区有典型霍乱症状，⼤便培养阴性，⽽⽆其他原因可查者；
③有吐泻症状，霍乱弧菌培养阴性，作⾎清凝集试验第2份⾎清抗体效价呈4倍以上增⾼者。
在⾮疫区，凡有典型泻吐症状，在病原学检查未确定时，或在霍乱流⾏期间，曾接触过霍乱患者，有腹泻症状⽽⽆其他原因可查者，均应⾼度怀疑为霍乱，在给予积极处理的同时，应作⼤便培养，隔⽇1次，连续3次阴性者，才可以否定诊断，并作出疫情更正报告。
霍乱弧菌的微生物学诊断检查方法
霍乱弧菌的微生物学诊断检查方法微生物学诊断由于霍乱流行迅速，且在流行期间发病率及死亡率均高，危害极大，因此早期迅速和正确的诊断，对治疗和预防本病的蔓延有重大意义。
直接镜检采取病人“米泔水样”大便或呕吐物。
镜检（涂片染色及悬滴法检查）观察细菌形态，动力特征。
细菌分离培养可将材料接种至碱性蛋白胨水37℃培养6～8小时后，取生长物作形态观察，并转种于碱性平板作分离培养，取可疑菌落作玻片凝集，阳性者再作生化反应及生物型别鉴定试验。
特异性制动试验取检材或新鲜碱性蛋白胨水培养物一滴，置于载玻片上，再加霍乱弧菌多价诊断血清，加盖玻片，用暗视野镜观察，3分钟内运动被抑制的即为阳性，此法优点是快速而特异操作简便，但必须有数量较多的弧菌才检出。
免疫荧光试验除一般免疫荧光法外，还可用荧光菌球法检查。
1.标本采集和运送:霍乱是烈性传染病,凡在流行季节和地区有腹泻症状的患者均应快速准确作出病原学诊断.在发病早期,尽量在使用抗菌药物之前采集标本.可取患者”米泔水”样便,也可采取呕吐物或尸体肠内容物,或采取肛门试子.标本应避免接触消毒液,采取的标本最好就地接种碱性胨水增菌,不能及时接种者可用棉签挑取标本或将肛门试子直接插入卡-布运送培养基中.送检标本装在密封,不易破碎的容器中,置室温由专人输送.甘油盐水保存液不适合于弧菌的运送.2．标本直接检查:荚膜肿胀试验：特异性抗血清与相应细菌的荚膜抗原特异性结合形成复合物时，可使细菌荚膜显著增大出现肿胀的试验常用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等的检测革兰染色：革兰染色过程所用四种不同溶液和作用：1、碱性染料这在简单染色中已讨论过，此处用结晶紫。
2、媒染剂其作用是增强染料与细菌的亲和力，更好地加强染料与细胞的结合。
常用的媒染剂是碘液。
3、脱色剂帮助染料从被染色的细胞中脱色。
利用细菌对染料脱色的难易程度不同，而将细菌加以区分。
革兰阳性细菌不易被脱色剂脱色，而革兰阴性细菌则易被脱色。
常用的脱色剂是丙酮或乙醇，这里所用的是95%的乙醇。
霍乱弧菌实验室检测完整版
中、重型病例 。 临床诊断病例：符合下列任一类病例均为临床诊断病例。 临床表现为轻、中、重型或中毒型病例，并在腹泻病患者日常生活用品或家居环境中
检出O1群或/和O139群霍乱弧菌；
在一起确认的霍乱暴发疫情中，暴露人群中临床表现为轻、中、重型或中毒型病例。 实验室确诊病例： 临床病人并粪便、呕吐物或肛拭子细菌培养分离到O1群或/和O139群霍乱弧菌 ； 在疫源检索中，粪便培养检出O1群或O139群霍乱弧菌前后各5天内有腹泻症状者。
挑可疑菌落、多价血清凝集
胶体金层析 卡检测
胶体金层析 卡检测
核酸提取 荧光PCR检测
血清分型、生化鉴定
问题：实验时间；灵敏度；初筛；等待时间
标本的采集和运输
采集：
病例：粪便、肛拭子、呕吐物 未使用抗生素之前 “健康”人：粪便、肛拭子 其他传播环节的标本：食物、水、操作台、砧板、下水道口……
要求：位置、数量
运输：
C-B运输培养基（pH8.4） 碱性蛋白胨水：不是最佳的，尤其6小时内还不能进行培养时，不要用 运输培养基用前预冷1-2小时，采样后不能立即运至实验室时，需冷藏
特定地区？
感染因素多样化
初级感染因素、衍生的感染因素
确诊 病例 采样检测
就诊
患者
- 临床及时发现病例 - 细致的流行病学调查 - 实验室检测与分析 - 信息整合 - 控制行动
标本-粪便、呕吐物、水体、食品、、、
前处理：运输、调pH
增菌：碱性蛋白胨水（水体：加十倍浓缩液），6h – 过 夜
涂平板，16h ： 4号琼脂、TCBS、庆大霉素
S
SS S
S
群霍乱弧菌的鉴定和分型
群霍乱弧菌的鉴定和分型l 血清分型用普通琼脂或碱性琼脂培养基上的菌苔进行血清分型。
分型使用小川型及稻叶型的单价血清作玻片凝集反应。
l.1 在小川型单价血清凝集，在稻叶型单价血清不凝集者为小川型。
l.2 在小川型单价血清不凝集，在稻叶型单价血清凝集者为稻叶型。
1.3 在小川型、稻叶型单价血清均呈明显凝集者为彦岛型。
2 试管凝集试验用生理盐水自1:20开始对倍连续稀释01群霍乱多价血清，每管含稀释血清O 历mL。
将被检菌在营养琼脂的16～18h培养物用0.2%福尔马林生理盐水制成每毫升约含18亿菌体(相当于细菌标准比浊管浓度)的悬液，每稀释血清管加入0.5mL;另将菌悬液0.5mL加入0.5mL生理盐水中作对照。
摇匀，置37℃3h观察初步结果。
再放4℃或室温过夜，观察最后结果。
生理盐水对照不出现自然凝集，能便试验菌出现十十凝集的血清最高稀释倍数为凝集滴度，凝集滴度达到或超过血清原效价一半的即可确定为01群霍乱弧菌。
对一次流行的首批病例菌株和玻片凝集反应不典型的菌株应做本试验。
3 古典型和埃尔托型的鉴别3.1 按表l所列的试验鉴别01群霍乱弧菌的两个生物型。
注:括弧内为少数菌株结果。
3.2 试验方法:a. 第N组霍乱噬菌体裂解试验:本项试验与噬菌体分型在同一平皿上进行，方法见C4.1.2。
b. 多粘菌素B敏感试验:将1.5%普通琼脂加热溶化，待冷却至5O℃z左右，按每毫升培养基加入50单位多粘菌素B，摇匀后倾注平皿，凝固后备用。
在平皿背面用玻璃笔划出若干方格。
将被检菌2～ 3h肉汤培养物一接种环点在培养基表面，待干后放37℃培养过夜，观察结果。
被检菌不生长或生长不足10个菌落为敏感，记录为十号。
c. 鸡血球凝集试验:在清洁平皿内划出方格，用直径4mm的接种环取一滴生理盐水滴在每个方格内，取被检菌18h琼脂培养物少许。
在生理盐水中制成浓厚菌悬液。
再用接种环各加一滴经洗涤三次的2.5%鸡血球生理盐水悬液，充分摇匀，肉眼观察结果。
霍乱弧菌检测的方法与结果探究
霍乱弧菌检测的方法与结果探究摘要目的：探究分离培养法和胶体金免疫层析法，两种霍乱弧菌检测方法和结果差异。
方法：从2015年至2016年，选取608例霍乱弧菌样本，同时使用分离培养法和胶体金免疫层析法进程检测，并就两种方法的结果符合率进行比较。
致性为优，符合率定位100%。
结果：608例霍乱弧菌样本中，培养法阳性20例，胶体金免疫层析法检测结果与培养法一致为阳性；培养法阴性588例，胶体金免疫层析法检测585例为阴性，3例为阳性，经培养法复核，确定3例为阴性。
结论：胶体金免疫层析法作为一种新兴的霍乱弧菌检测方法，可以快速完成霍乱弧菌的检测，且具有较高的准确性，将其应用于霍乱弧菌检测，可有效提高疫情防控质量。
关键词霍乱弧菌；检测的方法；结果霍乱弧菌（V.cholera）是霍乱的病原体，属于弧菌科，是革兰氏阴性菌的一种。
霍乱弧菌主要分为埃尔托生物型（EL-Tor bio-type）和古典生物型（Classical biotype）两种。
培养法是卫生部规定的霍乱弧菌标准方法，适用于各种霍乱弧菌标本，检测结果准确、可靠，但整体检测时间相对较长。
近几年，胶体金免疫层析法被提出用于霍乱弧菌标本检测，与培养法相比，胶体金免疫层析法检测更加快速。
本文针对两种检测方法进行对比，实验结果如下。
1材料与方法1.1材料pH8.6碱性蛋白胨水（杭州微生物试剂厂）；TCBS（硫代硫酸盐枸橼酸盐胆盐琼脂）；霍乱弧菌O1群多价血清和小川稻叶O139分型血清（浙江省疾病预防控制中心）；霍乱弧菌胶体金免疫快速检测卡（郑州博赛生物技术有限公司）。
所有试剂均在有效期以内。
1.2样本来源本组试验中608例霍乱弧菌样本，均收集于疑似霍乱感染者粪便以及霍乱疫情采集标本。
试验中检测为阳性的霍乱弧菌样本，均送至相关疾病预防控制中心进一步确认（其中呕吐物2份，肛拭18份）。
其余腹泻患者肛拭988分，均通过培养法检测验证为阳性。
1.3方法根据《霍乱防治手册》（第五版）规定进行病原菌分离培养和血清鉴定；胶体金免疫层析法操作方法如下：一，采取适量以增菌的碱性蛋白胨水滴入检测卡中，均匀摇晃，观察5min内的试验结果。
霍乱弧菌的选择分离及培养
牛肉膏粉 3g
氯化钠 5g
蔗糖10g
柠檬酸钠10g
无水亚硫酸钠3g
庆大霉素500U
琼脂15g
最终pH8.5±0.2
使用方法：
1、称取本培养基56g，加入蒸馏水或去离子水1 L，加热煮沸充分溶解，冷至50℃左右，每500mL培养基加入配套试剂1支 (SR0190)( 2.5mg亚碲酸钾)，摇匀，立即倾注平皿，待凝固后，备用。
2、取待微生物检测菌的新鲜纯培养物划线接种于琼脂平板上，于36±1℃培养20—24h。
质量控制：
下列菌株接种后于36±1℃培养20—24h，结果如下：
菌 名 菌 号 生长状况 菌落特征
霍乱弧菌 V60 好 淡灰色
大肠埃希氏菌 ATCC25922 被抑制 ——
贮 存：贮存于避光、阴凉干燥处，用后立即旋紧瓶盖。贮存期三年。
霍乱弧菌霍乱弧菌检测霍乱弧菌肠毒素副溶血弧菌鸡弧菌性肝炎霍乱弧菌致病副溶血性弧菌鳗弧菌河弧菌副溶血性弧菌检验
品种名称：庆大霉素琼脂
编号：025050
用 途：用于霍乱弧菌的选择性分离培养。
形态与特性：
古典型霍乱弧菌和ELtor弧菌比较典型，为革兰氏阴性菌，菌体弯曲呈弧状或逗点状，菌体一端有单根鞭毛和菌毛，无荚膜与芽胞。经人工培养后，易失去弧形而呈杆状。取霍乱病人米泔水样粪便作活菌悬滴观察，可见细菌运动极为或平板中生长良好。因其他细菌在这一PH不易生长，故碱性蛋白胨水可作为选择性增殖霍乱弧菌的培养基。
图册：
原 理：
蛋白胨、牛肉膏粉提供氮源、维生素和生长因子;氯化钠维持均衡的渗透压;蔗糖提供碳源;亚硫酸钠可刺激弧菌生长;柠檬酸钠、庆大霉素和亚碲酸钾及较高的pH可抑制革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性杂菌;霍乱弧菌对酸性环境比较敏感，因此该pH值可增强其生长;琼脂是培养基的凝固剂。
霍乱弧菌实验室检测
可疑菌落挑取
经典的鉴定步骤要求每个平板应挑取5个以上可疑菌落,转种于克氏双糖斜 面或者普通琼脂斜面待分纯培养后,再进行O1、O139群血清玻片凝集试验， 鉴于对霍乱疫情应急处理的考虑,现大多数监测实验室一般采用将血清玻片 凝集试验前置的做法,作为快速筛查的手段,直接对平板上生长的单个可疑菌 落进行玻片凝集试验,出现明显凝集时可做初步报告,对平板上出现可疑凝集 的菌株必须马上转种于克氏双糖斜面或者普通琼脂斜面,待纯培养物生长良 好后再次进行玻片凝集试验加以确证。 庆大霉素平板和4号琼脂：多呈半透明状，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并 随培养时间的延长而加深（由于这类培养基均含有亚碲酸盐成份）。 TCBS（硫代硫酸盐枸櫞酸盐胆盐琼脂）：菌落生长呈黄色发亮、表面光滑、 润湿、稍凸起、边缘整齐。 （TCBS平板生长的菌落不能直挑取进行玻片凝 集试验，需按经典方法进行纯培养后再进行玻片凝集试验）
分离培养（两管两板法）：
接种后的碱性蛋白胨水37℃培养过夜，取菌膜下表层培养物接种选择性培养 基（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板）．同时吸0.1～0.2 ml表层培养物转种于 10ml碱性胨水管中作二次增菌，37℃培养6～8h再划线接种于选择性培养基
平板分离及可疑菌落挑取
平板分离
选择性分离平板应采用9cm分离平板（不建议采用7cm平板），一个平 板分离一个样品（严禁一个平板分离2份或以上样品！！ ）。 样品平板分离时应进行分区划线分离，平板分离的单个菌落数量应该达到 50个以上。
霍乱的实验室检测
样品的采集和运输 不同样品的病原分离流程及技术要点
粪便 水体 水产品，食品等
平板分离及可疑菌落挑取 菌落鉴定 常用快速检测方法
检测工作中应关注的事项
胶体金检测条 荧光PCR检测
霍乱弧菌的分离与鉴定
要注意同一标本存在 O1 群和 O139 群等多个血清群霍乱弧菌混合的可能，每 份标本至少挑选 5 个以上的疑似菌落逐一进行鉴定。 4.1.2 氧化酶试验
试剂：1%盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸二甲基对苯二胺水溶液。 试验方法：取生长在非选择性培养基上的新鲜培养物涂抹在清洁的滤纸上， 然后滴加上述试剂，如培养物在 lmin～2min 内出现粉红—紫红—紫蓝色，有的 最后呈紫黑色，判断为氧化酶试验阳性；培养物不显色判为阴性。 4.2 菌株复核 经初筛阳性或可疑阳性的菌株，在发出初步鉴定报告的同时，应尽快送当地 疾病预防控制中心（CDC）进行复核鉴定。复核结果符合 O1 群或 O139 群霍乱弧 菌的菌株，按菌株管理的要求进行保存与上送；如复核结果出现疑问，应尽快将 菌株上送省级或以上 CDC（参比实验室）进行确认分析。菌株的复核鉴定应以纯 培养物为基础，至少应包括以下项目：血清凝集试验与血清分型、革兰氏染色、 粘丝试验、氧化酶试验、动力试验。对一次流行的首批病例菌株和玻片凝集反应 不典型的菌株应增做试管凝集试验。
10% NaCl
- - - - +/- - - - - - - -
O/129 敏感性
10μg
S① S R S R R R S R S R
150μg
S① S S S S S S S S S S S
①部分 O139 群霍乱弧菌为抗性（R）。
霍乱弧菌系统生化鉴定详见表 1。
表 1 部分弧菌科细菌的系统生化鉴定
霍拟副创溶河弗海 霍 麦 辛 鲨
项
乱态溶伤藻弧尼鱼 利 氏 辛 鱼
弧弧血弧弧菌斯弧 斯 弧 那 弧
目
菌菌弧菌菌
弧菌 弧 菌 提 菌
菌
菌
菌
弧
菌
荧光PCR检测霍乱弧菌流程与方法
荧光PCR检测霍乱弧菌流程与方法霍乱弧菌是引起人类霍乱的病原菌.也是我国传染病防治法规定的甲类传染病病原之一作为国际检疫传染病——霍乱的病原诊断.以检出O。
群霍乱弧菌或O。
剪群霍乱弧菌为准。
O.群霍乱弧菌可再分为古典生物型和埃尔托生物型埃尔托霍乱弧菌在外环境水源中长期存在.特别是在水体PH值为7.6—8.5、水温26—32cI=、氯化物260—278mg ／L的条件下抵抗力强.生长良好。
水体及水产品中的甲壳类、贝壳类、鱼类及两栖类水生动物(牛蛙、蟾蜍)等易受霍乱弧菌的污染。
1样品、材料和仪器1.1样品为水样和鱼1.2营养肉汤、营养琼脂、碱性蛋白胨水、PH8.4的庆大霉素琼脂培养基来源于北京陆桥技术有限责任公司。
I.3霍乱O。
群多价诊断血清、小川型血清、稻叶型血清、O。
剪群血清为兰州生物制品研究所产品。
1.4API20E编码及配套生化反应板为法国生物一梅里埃公司的产品。
1.5霍乱弧菌O，菌群实时荧光PCR检测试剂盒及霍乱弧菌通用型实时荧光PCR检测试剂盒为深圳太太基因工程有限公司研制1.6荧光PCR仪：博日FQD一33A2操作步骤2.1细菌的分离培养、玻片凝集及血清分型严格按照SN／T1239—20o3《国境口岸霍乱检验规程》来进行。
2.2API鉴定将营养琼脂平板上的纯菌落用API20E试验条进行鉴定根据说明表读反应.参照鉴定表、分析图索引和APILAB软件得到鉴定结果。
2.3实时荧光PCR检测霍乱弧菌按照深圳太太基因工程有限公司提供的试剂盒方法来进行。
2.3.1增菌液处理(样本处理区)取待测样本增菌液lml到1.5Hll无菌离心管中.8000rpm离心5min，尽量吸弃上清：加入50ulDNA提取液，混匀后沸水浴5min.13000rpm离心5min.取上清保存于一20cI=备用以待检测2.3.2扩增试剂准备(PCR前准备区、从试剂盒中取出PCR反应液.室温融化并振荡混匀.取出Taq酶及UNG酶.第一次使用时2000rpm 离心10s.以收集粘在管壁上的酶贮液设所需要的PCR反应管管数为nfn=1管阴性对照+1管阳性对照+样本数1，每个测试反应体系配制如下表：表1测试反应体系配制堕型垦生!竺璺竺用量(u1)22，50.50,06计算好各试剂的使用量.加入一适当体积离心管中.颠倒混匀.2000rpm离心10s.向设定的n个PCR反应管中分别加入23u1..转移至样本处理区。
霍乱弧菌检测方法
霍乱弧菌检测的快速方法霍乱是由霍乱弧菌引起的烈性肠道传染病, 发病急、来势凶猛、传播快是该病的特点, 因而及早培养鉴定出霍乱弧菌对控制该病的流行和治疗有极其重要的意义。
本文作者在1995年9 月～ 2000 年9 月期间, 对我科1 256 例急性腹泻患者粪便和呕吐物培养霍乱弧菌的方法进行改进, 大大缩短了阳性结果的报出时间, 现总结如下。
1 材料与方法1.1材料1.1.1 标本来源1995 年9 月～ 2000 年9 月本院门诊及住院急性腹泻患者新鲜粪便样本1 042 份, 呕吐物214 份。
1.1.2 试剂所用培养基均购自杭州天和微生物制品厂, 霍乱弧菌单克隆抗体购自卫生部兰州生物制品研究所。
1.2 方法用灭菌毛细吸管吸取1m l 患者米汤样粪便或直接将采便管棉拭子接种于10m l 1% 硷性蛋白胨水中, 置37℃培养箱作增菌培养。
快速方法为增菌2 小时后取表面生长物或菌膜转种普通琼脂平板, 6 小时后即可挑取可疑菌落进行鉴定。
另一方法为按常规方法增菌6～ 9 小时后转种于庆大霉素琼脂平板,均按《全国临床检验操作规程》进行鉴定。
2 结果应用快速方法在10 小时内可报出阳性结果, 常规方法则20 小时报出阳性结果。
1 256 份标本中, 共检出15 例霍乱弧菌,均为小川型, 两种方法的阳性率均为1119% (15ö1 256) , 符合率100%。
3 讨论霍乱是我国法定的甲类传染病, 国家要求在接诊24 小时内报出检验结果。
本文在急性腹泻患者粪便霍乱弧菌培养方面采用缩短增菌时间和转种普通琼脂平板的方法, 从传统的增菌6～ 9 小时再转种选择性培养基改为增菌2 小时后开始转种普通琼脂平板, 能使阳性结果在10 小时内发出报告, 比常规方法快10 小时, 对霍乱的诊断治疗均有重要的意义。
增菌2 小时即可转种是由于: (1) 霍乱患者急性期粪便和呕吐物中含有大量的堆乱弧菌, 增菌 2 小时后霍乱弧菌已被增殖数十倍, 此菌数已足以转种。
霍乱弧菌的分离与鉴定、霍乱诊断的相关实验技术、鉴别诊断.pptx
菌株的复核鉴定应以纯培养物为基础，至少应包括以下项目：革兰染色、黏丝试验、氧化酶试验、血清分型、 动力试验、CT毒素基因检测（按附录B）,也可选择生化鉴定条或全自动微生物生化鉴定系统。凝集反应不典型或者 怀疑为彦岛型的菌株应增做试管凝集试验。菌株血清群的鉴定也可用聚合酹链式反应（PCR）方法扩增01群和0139 血清群脂多糖特异性基因力来确定（按附录B）。
C.2.1肠产毒性大肠埃希菌（ETEC）性肠炎
潜伏期4h〜24h,有发热、恶心呕吐及腹部绞痛，腹泻呈黄水或清水样便，无脓血便,严重腹泻者亦可产生重度脱 水，婴幼患儿常因此而危及生命。
C.2.2肠致病性大肠埃希菌（EPEC）性肠炎
主要症状为腹泻，大便为黄色和黄绿色蛋花样稀水便，量较多，常有特殊腥臭味，重症者可有脱水等全身症状 。
A.2标本的送检
采得的标本应立即接种于培养基，不能立即接种的，应放入pH8.4〜9.2的碱性蛋白陈水或文腊二氏保存液或插 入Cary-Blail•半固体保存培养基中，放置于冷藏箱内保存、送检。粪便或呕吐物等标本与运送培养基或增菌液的比例 约为1:10,肛拭子应插入5m1.运送培养基或增菌液中。
A.3分离培养
诺如病毒感染在各年龄人群普遍易感，可引起暴发流行，是成人病毒性腹泻的首位病原体。临床症状主要以腹 泻和呕吐为主，水样便或稀便多见，可伴有腹痛、恶心、纳差、乏力、低至中度发热等。粪便标本诺如病毒检测阳 性。
C.6急性细菌性痢疾
由志贺菌引起，潜伏期Id〜2d,起病急，以发热、腹痛、腹泻、里急后重、脓血便为主要特征，有全身感染中毒 症状。重症患者可伴有头痛、全身肌肉酸痛甚至惊厥，可出现脱水和电解质紊乱相关症状。不典型的急性细菌性痢 疾以婴儿多见，多无全身中毒症状、不发热或低热，腹痛较轻，粪便呈水样或稀糊样，含少量黏液，左下腹可有压 痛，应注意鉴别。急性中毒性细菌性痢疾可出现高热，在儿童患者早期即可出现烦躁、谐妄、惊厥等，发病初期肠 道症状不明显。成人患者主要表现为黏液脓血便频繁，呈里急后重。从粪便或肛拭标本等检出志贺菌可确诊。
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霍乱弧菌的分离与鉴定濮阳市疾病预防控制中心一、标本的采集和送检:1.标本的采集：1)粪便标本：应争取在发病早期、服用抗菌药物之前采集；2)采便方法：可用棉拭采取自然排出的新鲜大便，亦可用直肠棉拭采便管由肛门插入直肠内3～5厘米处采取。
3)采样要求：☞水样便采取1～2毫升，成形便采取指甲大小的粪量。
病人呕吐物、沾染粪便的衣物、尸体的肠腔和口腔内容物亦可作为检材。
☞外环境样本可采取病人的污染衣物、剩饭菜、可疑食品、抹布、污水、坑塘水、井水、公厕粪便、苍蝇等。
☞按1:10比例置入碱性蛋白胨水增菌液中，迅速送往实验室。
4）肛拭采集的注意事项：1.棉拭子要用竹签，圆形、光滑以免采样时易断；2.棉拭子做的要稍大而紧固(避免采集时脱落)；3.采集者应穿戴一次性手套；4.采集前将棉拭子用碱性蛋白胨水(APW)蘸湿，多余的液体紧靠管壁挤出；5.采集时要求被采集者双腿分立、微屈、手扶墙或凳子趴下，劝其用单手或双手协助分开股沟(或采集者用左手分开股沟)，右手持棉拭子轻轻旋转插入肛门内约4～5cm(幼儿约2～3cm)处，转动数秒钟从紧靠肛环边的隐窝旋转擦取直肠表面黏液后退出；6.棉拭子在推进时如感觉遇到阻力，应调整角度后缓缓旋转推进，避免用力过大或推进太快造成肛壁出血而影响病原菌的检出；棉拭子进入的深度一定要够，否则采集的有效标本量会很少；7.采集的标本拭子应立即置入APW内，手接触的部分在管口折断弃去。
填写采样登记表(单)，并在采样管上填写被采集者的样品编号、姓名、性别、年龄，尽快送检。
二、快速诊断：1.直接镜检：为争取最快速度作出诊断，采取病人“米泔水样”大便或呕吐物，悬滴法镜检(最好用暗视野)，可见具有流星状动力的细菌。
2.特异性制动试验：☞取检材或新鲜碱性蛋白胨水培养物一滴，置于载玻片上，再加霍乱弧菌O1多价或O139诊断血清，加盖玻片，用暗视野显微镜观察，3分钟内流行状运动细菌被抑制的即为阳性，此法优点是快速而特异，操作简便，可☞在几分钟之内做出初步诊断。
但要求标本必须有较多数量的弧菌，免疫血清最好是不加防腐剂的。
3.早期玻片凝集试验：☞埃尔托弧菌在TCBS、4号琼脂及庆大霉素平皿上生长较快，37℃培养8～10小时，在其他杂菌尚未生长或长出很小菌落的情况下，埃尔托型菌落直径可达1～2mm。
将已长出较大半透明菌落或湿润菌苔的平皿取出，直接用霍乱多价血清做玻片凝集，阳性者可做初步报告。
琼脂平皿继续培养，接常规培养时间再作一次复查。
4.霍乱弧菌胶体金免疫层析快速检测：(1)原理：采用胶体金免疫层析双抗体夹心法，检测标本中霍乱弧菌。
以胶体金作为标记物，交联抗霍乱弧菌(O1群/O139群或O1群E1Tor型小川血清型、稻叶血清型)单克隆抗体，与样品中的霍乱弧菌(O1群/O139群)结合。
形成双抗体夹心一步法，呈现出目测可见的红色条带，显色程度与抗原含量成正比。
(2)特点：☞灵敏度高、特异性强，操作简便、快速，省力省时；☞对于典型霍乱病人水样或米泔样便结果准确、易于判读；☞但对于含霍乱弧菌少的粪便标本易出现假阴性；☞对脓血便标本易出现假阳性。
3)操作步骤：☞将检测卡放置与洁净、干燥的工作台上；☞实验前，请将试剂恢复至室温；☞用吸管取病人水样便样品2～3滴，加入检测卡一端的加样孔，计时并观察反应结果；☞2-15分钟内观察结果，20分钟之后结果不能判读。
(1) 滤样纸（加样区）；(2) 玻璃纤维膜，膜上吸附着干燥的金标抗原；(3) 硝酸纤维素膜，膜上包被的抗原和抗体呈线状；(4) 吸水纸。
三、直接分离、培养：☞急性期病人水样大便标本在增菌培养的同时可用选择性培养基直接划线分离。
目前常用的强选择性培养基有TCBS琼脂、4号琼脂和庆大霉素琼脂等。
☞置37℃10～14h孵育培养。
四、APW增菌、分离：☞所有粪便标本都应经过增菌，尤其是恢复期病人，带菌者或用过抗菌药物的病人标本含菌量少，单靠直接分离不易检出，需经碱胨水37℃增菌6～8小时后分离(夏日可将运送时间计算在内)；☞标本含菌量少时，为提高检出率可实行2次增菌，取第一次碱胨水增菌后的培养物表层液0.1～0.2毫升，接种于8～10毫升的碱胨水中，37℃培养6～8小时后再做分离；☞霍乱弧菌好氧，易形成的菌膜，故在取出增菌管时动作要轻，接种环于菌膜下取一满环，划线接种于TCBS或4号琼脂平板37℃10～14h孵育培养。
五、血清学凝集试验：1.玻片凝集试验：☞自分离培养基上挑取可疑菌落与O1群霍乱多价诊断血清、O139群霍乱诊断血清以及稻叶、小川型诊断血清做玻片凝集试验；☞同时注意做盐水凝集对照试验。
2.要求及注意事项:☞有的标本可能同时存在非O1群霍乱弧菌，可疑菌落较多时，应挑选5个以上的菌落逐个进行玻片凝集检查;☞必要时，取原划线菌苔边缘透明部分再做玻片凝集(对一次流行的首批病人进行检验时尤应注意)。
☞平皿分离未获分散的单个菌落，而在密集部位仍有可疑菌落时，应将该部分再做分离或经增菌后再做分离;☞从恢复期病人分离出菌落典型但不凝集的弧菌，这时应以霍乱粗糙型血清做玻片凝集，以确定是否为粗糙型或NAG弧菌；☞注意当霍乱弧菌在4号及庆大霉素培养基上生长过久(超过36小时)时，会出现菌落粘稠、血清凝集假阴性现象；☞故应取新鲜培养物(10～14h)作凝集试验，凝集的菌落立即转种营养琼脂平板。
☞小川型菌株有时在稻叶型单价血清中可出现弱凝集，这并非彦岛型，而是小川型含有少量C抗原成分的缘故；☞首例病人应以两个单价血清的试管凝集试验确定。
六、初步鉴定试验：1.氧化酶试验：在非选择性或非鉴别性培养基如营养琼脂的新鲜培养物上滴加氧化酶试剂1滴，并使其流开。
或将菌落用竹签或牙签挑至滴有试剂的滤纸上，在1分钟内出现粉红－紫红－紫蓝色（有的最后呈黑紫色）为氧化酶阳性。
（肠杆菌科细菌多不变色或变成粉红色后很快退色为氧化酶阴性）。
氧化酶试验注意事项：试验时避开含铁物质（如接种环）。
不能直接取产酸培养基上的菌落，不能取含还原剂的培基及含亚碲酸盐培基上的菌落(亚碲酸盐培养基可抑制氧化酶)，以免出现假阳性和假阴性。
2.拉丝试验：在玻片上加一滴试剂，取一接种环被检菌的新鲜琼脂培养物在试剂旁边研磨均匀，再与试剂混合制成浓厚悬液。
阳性者很快(30S内)由混变清并变得很粘稠，用接种环挑取时，可以拉出细丝来。
阴性者呈均匀悬液状态，与蒸馏水对照相同。
（古典型、埃尔托型和O139群霍乱弧菌均阳性。
）弧菌科菌属氧化酶试验、拉丝试验鉴别表3.O/129(二氨基二异丙基喋啶)敏感试验：☞用接种环或灭菌棉拭子在含0.5％氯化钠的普通平皿上均匀涂抹待检菌，放上10µg、150µgO/129磷酸盐药敏纸片各一片，37℃培养过夜。
凡药敏纸片周围出现抑菌圈者为敏感。
☞古典型、埃尔托型霍乱弧菌二者均敏感；☞O139群霍乱弧菌10µg、150µg均不敏感。
七、初步结果报告：B霍乱弧菌以血清学鉴定为主，结合菌落形态、特征和初步生化反应可做出判定。
凡具备弧菌菌落特征、与O1群或O139群多价血清凝集，O1群并可用单价血清分型即可判定。
:首例病人应辅以氧化酶、拉丝试验、O/129敏感试验。
基层CDC至此即可上报。
8上报国家需做生化、噬菌体-生物分型试验。
+报告名称－－“稻叶/小川型O1群埃尔托型霍乱弧菌”或“O139群埃尔托型霍乱弧菌”。
八、生化鉴定试验：九、噬菌体-生物分型：1. 古典型和Eltor分型：目前仍依靠第IV组霍乱噬菌体常规稀释液(106/毫升)裂解试验、多粘菌素B敏感试验、鸡血球凝集、V-P和溶血试验进行两种生物型的鉴别仅作参考。
埃尔托型已出现大量非溶血菌株，因此溶血试验已不能作为区别两个生物型的主要方法。
O1群霍乱弧菌古典型和El-Tor生物型的鉴别(1)噬菌体分型：根据五株国内分离的5种弧菌噬菌体(VP1～VP5)将埃尔托型霍乱弧菌分成32个噬菌体型(见下表)。
方法：利用双层琼脂平皿法进行噬菌体滴皿裂解试验。
(2)生物分型：根据菌株的溶原性、对溶原噬菌体的敏感性、山梨醇发酵试验和溶血试验等四个生物学性状，将埃尔托弧菌分成12个生物型。
埃尔托霍乱生物分型表埃尔托霍乱弧菌噬菌体-生物分型表十、O1群与O139群霍乱弧菌的鉴别：十一、霍乱菌种的登记、保存、上送和管理:1.霍乱菌株的登记：@基层实验室所检获的阳性菌种及可疑菌种，均应作好菌株来源详细情况的登记工作,包括编号、被检人或物名称、菌株来源(病人、带菌者或外环境)、分离地点(地址)及初步鉴定结果(见省CDC “河南省霍乱监测方案”附表),一式两份,一份自己保存,一份随菌种上送。
2.霍乱种株的保存：-对初步鉴定的霍乱弧菌及可疑菌株(包括不凝集弧菌)，均应接种半固体菌种管培养基，经37℃过夜培养，用胶塞或石蜡封口，室温保存，切勿放入冰箱，因霍乱菌种半固体的最佳保存环境是18～25℃(一般可存活4～5年)。
N霍乱弧菌在4 ℃～8℃以下极易死亡。
3.霍乱种株的上送：E菌、毒种的上送工作是程序，也是制度。
E按照《中华人民共和国传染病防治法》、卫生部规定：各疫点市(县)在本年度疫情结束后必须立即收集整理当地分离到的所有霍乱菌株和可疑菌株，认真登记、造册，连同菌种一并派专人(2人)护送上级市(地)CDC；市(地)防疫站收集、整理所辖市、县上送菌种后，再届时按毒菌种管理规定上送省CDC，最后由省CDC统一进行编号、登记、整理备案，并进行血清学、生化学及噬菌体-生物分型鉴定、药物敏感性测定后上报国家CDC和卫生部。
4.霍乱种株的管理：O相关法规：《中华人民共和国传染病防治法实施办法》和卫生部菌种管理委员会制定的《中国医学微生物菌种保藏管理办法》。
O菌（毒）种的保藏由国务院卫生行政部门指定的单位负责。
O一、二类菌(毒)种的供应由国务院卫生行政部门指定的保藏管理单位供应。
三类菌(毒)种由设有专业实验室的单位或者国务院卫生行政部门指定的保藏管理单位供应。
O认真做好登记，统一编号，冻干保存，按期传代、鉴定，并作好有关检验记录。
在保存过程中发生菌、毒种变异或死亡，应及时上报科主任及主管部门。
O当地所检出的地方菌、毒株应及时上报，因工作需要暂时保留的菌、毒株也应按上级规定的时间进行销毁处理。
O新发现的菌、毒种，要做好原始记录，一并上报主管部门复核确认。
O使用一类菌(毒)种的单位，必须经国务院卫生行政部门批准；使用二类菌(毒)种的单位必须经省级政府卫生行政部门批准；使用三类菌(毒)种的单位，应当经县级政府卫生行政部门批准。
O一、二类菌(毒)种，应派专人向供应单位领取，不得邮寄；三类菌(毒)种的邮寄必须持有邮寄单位的证明，并按照菌(毒)种邮寄与包装的有关规定办理。
O未经上级主管部门批准，任何单位及个人不得以工作之便，进行国际间各类菌、毒种交流。