脱氢酶活性法
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
生物膜活性分析方法——
脱氢酶活性法
废水生化处理的实质是微生物所产生 的多种酶化一系列生物氧化还原的反应。 其中脱氢酶能使被氧化的有机物氢原子活 化并传递给特定的受氢体。因而脱氢酶的 活性DHA反映了活性微生物量及其对有机物 的代谢能力及生物处理设施的运行效果。 脱氢酶活性的检测在污水生化处理中正 日益受到人们的重视。
脱氢酶对生物体的重要意义
脱氢酶是由活生物体产生的一种蛋白质, 它能够促使有机物质脱氢,从而将氢原子传 递给特定的受氢体而完成氧化还原反应.微 生物脱氢酶是微生物降解有机污染物、获 得能量的必需酶。
DHA的检测方法及比较
测定脱氢酶的方法很多，但其思路基本一 致。即在含有微生物的水样中加入作为指示剂 的人工受氢体，水中的有机质在脱氢酶的作用 下，发生脱氢反应，人工受氢体接受氢原子被 还原而显色或褪色，从而使溶液反应前后颜色 深度发生变化。检测DHA的方法按受氢体不同 分类，常见的人工受氢体包括亚甲基蓝、刃天 青、TTC、INT等。
取活性污泥,3000r/min离心10分钟。弃去上清液,称污 泥湿重,用蒸馏水配成浓度为33g/L的待用污泥悬浮液。分 别取定量待测污泥悬浮液,各加入Tris一Hcl缓冲溶液2ml和 0.4%INT溶液1ml,置于37℃恒温水浴摇床中.反应一定时间 后,滴入浓硫酸3滴,以终止酶的反应。加人丙酮5ml,在常温 下进行振荡萃取。放置片刻,待溶液分层后,移取上清液于 1cm比色皿中.以试剂为空白作对照,用722型分光光度计在 485nm处测定吸光度(A)值.在一定条件下,吸光度(A)值的大 小表示了活性污泥脱氢酶活性的高低。
Biblioteka Baidu
4、用INT作为受氢体测定活性污泥活 性。该法测定简便，灵敏可靠，使用一般 仪器即可，非常适用于污水处理厂的日常 管理工作。但解军等曾提到，相对于TTC， INT零售价格较高，且国内不易买到，客观 上限制了国内学者对其的研究与应用。因 此就目前来讲研究和应用最多的是TTC-DHA 测定法。
INT法测定方法
1、亚甲基蓝测定 DHA的过程是一个褪色 过程。即有机质在脱氢酶作用下脱氢而被 氧化，将氢传递给氧化性化合物，亚甲基 蓝作为受氢体最终转化为无色物质，依据 其褪色速度可推测脱氢酶的活性 。 2、刃天青的反应机理与亚甲基蓝基本 相同，但反应过程相对比较复杂。
3、TTC-DHA测定法是以氧化还原性染料 TTC作为指示剂，使无色的 TTC 在活性微 生物细胞内充当最终受氢体。当微生物细 胞内有脱氢反应发生时，TTC便接受氢原子 被还原成红色的三苯基甲 臜（TF）。用特 定的萃取剂提取TF，根据生成TF的量来反 映脱氢酶活性。但另外据文献报道，用 TTC法测定DHA溶液显色浅、易褪色、反应 时间长（大于2h），不能及时反馈微生物 群体的生物活性信息。
TTC法测定方法
标准曲线的制作:在分液漏斗中依次注入1,2,3,4,5,6 mL浓度 为1 g/L TTC-葡萄糖标准溶液,2 mLTris-HCI缓冲溶液及1 mL10%Na2S新配溶液,摇匀;待溶液充分显色后,准确加入甲 苯溶液5 mL,振摇,完全提取TF.放置片刻;待溶液分层后,移至 1 cm比色皿中稳定2 min.取有机溶液层用752紫外分光光度 计在波长485 nm处,测对应的吸光度(A)值,对脱氢酶活性作 图,以试剂空白作对照,绘制标准曲线. 生物膜脱氢酶活性测定:取生物膜制备液2 mL于带塞试管 中,依次加入Tris-HCl缓冲液、0.1 mol/L葡萄糖液、0.5%TTC 各2 mL,置入37±1℃恒温箱中培养6 h后取出,加2滴浓硫酸 终止反应,准确加入5 mL甲苯,振摇,在4 000 rpm下离心5 min, 取有机溶剂层比色.在上述条件下,将1 h产生1 ug TF的量为1 个酶活力单位。
脱氢酶活性法的应用
由于DHA 在很大程度上反映了生物体的 活性状态,因而在废水生化处理中成为考察 污泥活性的一项重要指标,而且其检测方法 在评价化学毒物和金属毒物的毒性、土壤 污染等领域中也已发展为一种重要的生化 分析方法。
主要参考文献
• 顿咪娜,胡文容,裴海燕,解 军.脱氢酶活性检测方法及应用[J]. 工业水处理2008-10,28（10）. • 安立超,钮虹,曾拓,衣海英.测定活性污泥脱氢酶活性的研究 [J].污染防治技术1996.42(6). • 解军,祁峰,裴海燕,胡文容.脱氢酶活性检测方法及其在环境 监测中的应用[J].中国环境监测2006.22(5). • 李今,吴振斌,贺锋.生物膜活性测定中TTC-脱氢酶活性测定 法的改进 [J].吉首大学学报(自然科学版)2005.26(1).
脱氢酶活性法
废水生化处理的实质是微生物所产生 的多种酶化一系列生物氧化还原的反应。 其中脱氢酶能使被氧化的有机物氢原子活 化并传递给特定的受氢体。因而脱氢酶的 活性DHA反映了活性微生物量及其对有机物 的代谢能力及生物处理设施的运行效果。 脱氢酶活性的检测在污水生化处理中正 日益受到人们的重视。
脱氢酶对生物体的重要意义
脱氢酶是由活生物体产生的一种蛋白质, 它能够促使有机物质脱氢,从而将氢原子传 递给特定的受氢体而完成氧化还原反应.微 生物脱氢酶是微生物降解有机污染物、获 得能量的必需酶。
DHA的检测方法及比较
测定脱氢酶的方法很多，但其思路基本一 致。即在含有微生物的水样中加入作为指示剂 的人工受氢体，水中的有机质在脱氢酶的作用 下，发生脱氢反应，人工受氢体接受氢原子被 还原而显色或褪色，从而使溶液反应前后颜色 深度发生变化。检测DHA的方法按受氢体不同 分类，常见的人工受氢体包括亚甲基蓝、刃天 青、TTC、INT等。
取活性污泥,3000r/min离心10分钟。弃去上清液,称污 泥湿重,用蒸馏水配成浓度为33g/L的待用污泥悬浮液。分 别取定量待测污泥悬浮液,各加入Tris一Hcl缓冲溶液2ml和 0.4%INT溶液1ml,置于37℃恒温水浴摇床中.反应一定时间 后,滴入浓硫酸3滴,以终止酶的反应。加人丙酮5ml,在常温 下进行振荡萃取。放置片刻,待溶液分层后,移取上清液于 1cm比色皿中.以试剂为空白作对照,用722型分光光度计在 485nm处测定吸光度(A)值.在一定条件下,吸光度(A)值的大 小表示了活性污泥脱氢酶活性的高低。
Biblioteka Baidu
4、用INT作为受氢体测定活性污泥活 性。该法测定简便，灵敏可靠，使用一般 仪器即可，非常适用于污水处理厂的日常 管理工作。但解军等曾提到，相对于TTC， INT零售价格较高，且国内不易买到，客观 上限制了国内学者对其的研究与应用。因 此就目前来讲研究和应用最多的是TTC-DHA 测定法。
INT法测定方法
1、亚甲基蓝测定 DHA的过程是一个褪色 过程。即有机质在脱氢酶作用下脱氢而被 氧化，将氢传递给氧化性化合物，亚甲基 蓝作为受氢体最终转化为无色物质，依据 其褪色速度可推测脱氢酶的活性 。 2、刃天青的反应机理与亚甲基蓝基本 相同，但反应过程相对比较复杂。
3、TTC-DHA测定法是以氧化还原性染料 TTC作为指示剂，使无色的 TTC 在活性微 生物细胞内充当最终受氢体。当微生物细 胞内有脱氢反应发生时，TTC便接受氢原子 被还原成红色的三苯基甲 臜（TF）。用特 定的萃取剂提取TF，根据生成TF的量来反 映脱氢酶活性。但另外据文献报道，用 TTC法测定DHA溶液显色浅、易褪色、反应 时间长（大于2h），不能及时反馈微生物 群体的生物活性信息。
TTC法测定方法
标准曲线的制作:在分液漏斗中依次注入1,2,3,4,5,6 mL浓度 为1 g/L TTC-葡萄糖标准溶液,2 mLTris-HCI缓冲溶液及1 mL10%Na2S新配溶液,摇匀;待溶液充分显色后,准确加入甲 苯溶液5 mL,振摇,完全提取TF.放置片刻;待溶液分层后,移至 1 cm比色皿中稳定2 min.取有机溶液层用752紫外分光光度 计在波长485 nm处,测对应的吸光度(A)值,对脱氢酶活性作 图,以试剂空白作对照,绘制标准曲线. 生物膜脱氢酶活性测定:取生物膜制备液2 mL于带塞试管 中,依次加入Tris-HCl缓冲液、0.1 mol/L葡萄糖液、0.5%TTC 各2 mL,置入37±1℃恒温箱中培养6 h后取出,加2滴浓硫酸 终止反应,准确加入5 mL甲苯,振摇,在4 000 rpm下离心5 min, 取有机溶剂层比色.在上述条件下,将1 h产生1 ug TF的量为1 个酶活力单位。
脱氢酶活性法的应用
由于DHA 在很大程度上反映了生物体的 活性状态,因而在废水生化处理中成为考察 污泥活性的一项重要指标,而且其检测方法 在评价化学毒物和金属毒物的毒性、土壤 污染等领域中也已发展为一种重要的生化 分析方法。
主要参考文献
• 顿咪娜,胡文容,裴海燕,解 军.脱氢酶活性检测方法及应用[J]. 工业水处理2008-10,28（10）. • 安立超,钮虹,曾拓,衣海英.测定活性污泥脱氢酶活性的研究 [J].污染防治技术1996.42(6). • 解军,祁峰,裴海燕,胡文容.脱氢酶活性检测方法及其在环境 监测中的应用[J].中国环境监测2006.22(5). • 李今,吴振斌,贺锋.生物膜活性测定中TTC-脱氢酶活性测定 法的改进 [J].吉首大学学报(自然科学版)2005.26(1).