第六章 原生质体培养和体细胞杂交

第六章原生质体培养和体细胞杂交

第一节原生质体分离与培养

一、原生质体培养的意义与研究概况

原生质体（protoplast，PPT）: 用机械或酶解法去掉细胞壁的裸露细胞。

1. 原生质体培养的意义与研究概况

1.1 培养意义

1）体细胞杂交；作物遗传改良，这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供新的育种方法。两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法却成为可能。

2）遗传转化的受体，避免嵌合体；

3）突变体筛选：体细胞无性系变异+ 离体诱变；

4）基础研究：细胞壁再生、膜结构、跨膜运输、病毒侵染、抗寒性、抗热性等；

5）种质资源超低温保存，并可研究低温伤害与胞内结冰等；

6）细胞器和大分子分离。

1.2 研究概况

1880，Hanstein, 提出原生质体；

1892，Klercker, 机械法分离少量原生质体；

1960，Cocking，纤维素酶分离番茄幼根，得大量活性原生质体，奠基；

1968，纤维素酶和离析酶上市，迅速发展；

1971，Takebe，酶解分离烟草叶肉原生质体，再生植株；

1985，Fujimura等，世界第一例禾谷类作物，水稻原生质体再生植株；

1986，通过甘蓝型油菜单个原生质体培养获得再生植株。单个原生质体培养成功；

至1999，46科、161属、368种高等植物，原生质体再生植株，但若干重要作物仅限于少数基因型，再生率不高，培养基和培养程序复杂，规律少。

二、原生质体的分离与纯化

2.1 原生质体分离

2.1.1 原则：大量、避免损伤，高活力，能进行分裂并形成愈伤组织或胚状体是原生质体培养成功的基础。

取材：叶片，愈伤组织，悬浮细胞

2.1.2分离方法：

1）机械法: 用解剖刀切碎质壁分离的组织，再通过质壁分离[plæz’mɔlisis]的复原释放出原生质体。

优点：物理损伤，排除了外加酶的有害影响。

缺点：产量低，操作不便，只限于能发生质壁分离的组织（适于高度液泡化细胞，不适于分生组织）；费时费力。

补充：

细胞壁组成：

a. 胞间层middle lamella：位于两个相邻细胞之间，为两相邻细胞所共有的一层膜，主要成分为果胶质。

b. 初生壁The Primary Wall：位于胞间层内侧。主要成分为纤维素、半纤维素，

c. 次生壁secondary wall：位于质膜和初生壁之间。主要成分为纤维素，并常有木质存在。2）酶解法：常用混合酶液一步完成，广泛应用。

叶肉细胞、愈伤组织和悬浮细胞,

缺点：不纯的酶制剂可能对原生质体有害。

2.1.3分离原生质体的酶液组成

1）细胞壁组成：纤维素25%~50%，半纤维素53%，果胶质5%。

2）酶液的组分及其作用：以最少品种和最少量，但能分离得到健康的原生质体为准。纤维素酶和果胶酶为必需酶。一般叶片用纤维素酶和果胶酶；愈伤组织或根再添加半纤维素酶。

纤维素酶：必需，降解纤维素，

果胶酶：必需，降解果胶质，

离析酶：降解果胶质，

半纤维素酶降解半纤维素，

蜗牛酶或胼胝质酶：降解小孢子壁（胼胝质）；

崩溃酶：兼具纤维素酶、果胶酶等酶活；

3）渗透稳定剂：促进酶解作用，保持原生质体的完整性，使既不涨破又不因过分收缩而破坏内部结构。

糖醇系统:甘露醇、山梨醇、葡萄糖和蔗糖

甘露醇：调节渗透压，应高于原生质体，0.3~08M；

盐类系统:CaCl2、MgSO4、KCl 和葡聚糖硫酸钾

CaCl2：稳定质膜，提高活力；

KH2PO4/葡聚糖硫酸钾：稳定质膜，提高活力；

MES（2,N-氮吗啉-乙基磺酸）：稳定pH；

pH：5.6~5.8。

2.1.4常用CPW液(细胞-原生质体清洗液)配制酶液和洗涤液。

CPW液的组成：

KH2PO4 27.2mg/L

KNO3 101.0mg/L

CaCl2·2H2O 1480.0mg/L

MgSO4·7H2O 246.0mg/L

KI 0.16mg/L

CuSO4·5H2O 0.025mg/L

pH 5.8

2.1.5 用酶法制备原生质体的程序

从带菌叶片分离：

预处理→(表面消毒→去表皮/擦伤/切碎)→酶解分离(25~30℃)，避光，静置或间断低速震荡，30min~20 h) →纯化。

从无菌苗、愈伤和悬浮细胞分离：省去消毒和去皮。

预处理：主要目的是便于原生质体分离和促进细胞分裂, 高渗hypertonic [haipə'tɔnik] 、激素、低温等。

去表皮或擦伤：利于酶液渗入和PPT释放。

2.1.6 酶解条件

最主要的是酶处理时的温度和pH。

不同的酶需要的pH值不一样，但pH大于6时不利于原生质体生存。

酶解时间因材料而不同，以原生质体游离下来为准。一般不要超过24h，时间太长不利于原

生质体培养，对以后培养中的细胞生长和分裂有影响。

酶解温度一般为25~27℃。

一般在黑暗中进行，叶片分离原生质体可在静置条件下进行，悬浮细胞由于壁厚，培养（分离）过程中间断低速震荡有利于酶渗透。

2.2 原生质体的纯化

经酶解处理后，得到的混合物是一个由原生质体、细胞团与细胞碎片等组成的混合液，只有将杂质和酶液去掉，使原生质体纯化，才能进行培养。

2.2.1目的：去除细胞团、细胞碎片、酶液。

2.2.2方法：过滤和离心相结合。

a. 收集：用孔径40~100μm的不锈钢网stainless steel net 、尼龙网nylon net 、镍丝网wire netting of nickel过滤收集；

b.洗涤：将网下物低速离心,去掉上清液,再加无酶液的CPW液悬起原生质体,再离心,弃上清,重复几次即可.CPW液在500~800 rpm离心洗涤；

用培养基纯化。

d. 方法：

上浮法: 将酶解的原生质体与蔗糖溶液（23%左右）混合，混有较多叶片及少量老细胞时，适用于高度液泡化的细胞

下沉法: 将原生质体与13%的甘露醇混合，

界面法:将原生质体与13%的甘露醇混合，然后加到23%的蔗糖溶液顶部，形成一个界面。两种方法中，均在500-1000rpm下离心5-10分钟，会在蔗糖溶液顶部或者甘露醇溶液底部形成一条原生质体带。

2.3 原生质体的活力检测

方法：活体染色、观察胞质环流、测定呼吸强度等。

活体染色：

1) 伊凡蓝(Evans)染色：质膜完好者燃料不能进入，损伤者染色。

2) FDA(荧光素双醋酸酯, FDA )染色：二乙酸荧光素/荧光素双醋酸酯，常用。

FDA无极性和荧光，能透过质膜；FDA经酯酶分解为荧光素，后者为具有荧光的极性物质，不能自由出入细胞膜，从而在细胞中积累。在紫外光照射下，发出绿色荧光。相反如果是死细胞，则不会发出绿色荧光，活力低者荧光弱。

2.4 影响原生质体分离的因素

影响原生质体产量和质量的因素很多，

1）供体材料：

基因型与生理状态：

幼嫩、生长旺盛、活力强者可获得高活力PPT，并利于培养和再生。

双子叶：多用叶片、子叶、胚轴；

单子叶：多用胚性愈伤和悬浮细胞。

2）酶液及酶解方法：

避免高浓度、长时间：酶制剂中含酚类、核酸酶和蛋白酶等，对PPT 有毒害。

Ca2+, PVP(聚乙烯吡咯烷酮, polyvinyl [ˌpɔli'vainil ] pyrrolidone): 利于分离与高活力。

一/二步法：污染多/分离好，预试。

三、原生质体培养及植株再生

3.1 培养基