第三章基因工程第一节基因工程工具酶wangjx[1]
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加热15min仍具活性）, 用于除去DNA样品中的RNA分子
2. 核酸酶S7，亦称微球菌核酸酶，对RNA敏感，用于除去
蛋白质合成系统中的内源mRNA
（三）、RNase H
作用于DNA-RNA杂交分子中的RNA链，用于cDNA文 库建立时除去RNA链以便第二条链cDNA链的合成。
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第三章基因工程第一节基因工程工具 酶wangjx[1]
3. 外切酶活性特点
1) 反应底物：互补ds-DNA 2) 碱基释放速度：C>>A-T>>G 3) 反应产物：5’-单磷酸核苷和具缺口或5’-端突起的 ds-DNA，过度反应将导致DNA降解
4. 用途
1) 核酸（DNA）标记 2) 基因突变----缺失 3) DNA序列测定时作顺序缺失 5. 使用注意事项 1) 正式使用前，测定在一定条件下酶的反应速度 2) 在一定条件下，ExoIII不能作用GC富集区(来自 于cDNA加尾)
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第三章基因工程第一节基因工程工具 酶wangjx[1]
2. II型甲基化酶对限制酶活性的影响
１） 抑制同种限制酶的活性
M.BamHI GGATmCC—BamHI(GGATCC)
M.EcoRI GAmATTC—EcoRI(GAATTC)
２） 抑制不同种限制酶的活性
a. 顺序完全重叠 如：M. ClaI（ATCGmAT）----TaqI （TCGmA）
SacI CCGC GG
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第三章基因工程第一节基因工程工具 酶wangjx[1]
（五）、 限制酶的用途
1. DNA重组 2. 限制酶（物理）图谱绘制
3. 突变分析（RFLP分析）
4. 限制酶的部分酶切与完全酶切
附：IIS型限制酶的特点
1. 具有特异型核苷酸顺序识别能力，但该顺序不具
有对称结构。
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第三章基因工程第一节基因工程工具 酶wangjx[1]
•ds-DNA结构: 切口, 缺口, 断口
•3'HO P5'
•3'HO P5'
•缺口(gap)
切口(nick)
断口(cut)
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第三章基因工程第一节基因工程工具 酶wangjx[1]
•5'P •3'HO
•ExoIII的外切酶和RNaseH的作用
•ExoIII用于顺序缺失
•1 2 3 4 a b c
• 34abc
•
4abc
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•1 2 3 4 a b c
•a b c
第三章基因工程第一节基因工程工具 酶wangjx[1]
（二）、RNase（三）、RNaseH
（二）、RNase
大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去DNA样 品或蛋白质合成系统中的RNA分子。 1. RNase A 分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂（100℃
b. 顺序边界重叠 如：M. BamHI（GGATmCC）---MepI（mCCGG）
３） 抑制不同种限制酶的部分活性
M．TaqI（TCGmA）---HindII（GTPyPuAC）：
GTCAAC，GTTAAC，GTCGmAC，GTTGAC
3. 甲基化酶的用途
１） 改变某些限制酶识别顺序的特异性，以便重组体
2. II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在Ｅ.
coli中这两种基因位于质粒上。
3. III型：修饰酶与Ｉ型酶相同，hsdＭ与hsdＳ基
因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。
上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有 相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基
因工程中。
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第三章基因工程第一节基因工程工具 酶wangjx[1]
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第三章基因工程第一节基因工程工具 酶wangjx[1]
（三）、限制酶的特点
1. 识别顺序和酶切位点
１）识别４-8个相连的核苷酸
MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC BamHI GGATCC：PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC；
SfiI GGCC N N N N N GGCC
（四）、 DNase I
1. 特点：具内切酶活性，作用于ds -DNA，但无核苷酸序列
特异型，产生5’-P低聚核苷酸; Ca2+ , Mg 2+ 或Ca2+ , Mn2+可 使酶活达最大值
•5'P •3'HO
Fra Baidu bibliotek
•OH3'
• ExoIII
•P5'
•ExoIII •用于
•DNA •标记
•3'HO •P5'
• ExoIII
•1 2 3 4 a b c
•[α-32P] •dCTP
•OH3'
•5'P
•[α-32P] •dCTP
•1 2 3 4 a b c
• 234abc
•1 2 3 4 a b c
第三章基因工程第一节 基因工程工具酶wangjx
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2020/12/7
第三章基因工程第一节基因工程工具 酶wangjx[1]
一、限制性内切酶
•（一）、限制修饰系统的种类 •（二）、限制性内切酶的定义、命名 •（三）、限制酶的特点 •（四）、异源同序酶（isoschizomer， 同裂酶）
和腺嘌呤发生甲基化，形成5’-甲基胞嘧啶和6’-甲基腺
嘌呤。
在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与
相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制
酶作用位点可同可不同。
如：M. EcoRI GA mATTCC EcoRI G AATTC 不同
M．HpaI C mCGG
HpaI C CGG 相同
•HaeⅠ的识别序列
•5’- GTTAAC-3’ •3’- CAATTG -5’
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第三章基因工程第一节基因工程工具 酶wangjx[1]
•5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’ •3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’
•5’NNNNNG
•3’NNNNNCTTAA p
3’-CCTAC(Ｎ)13-5’
3’-CCTAC(N)13
ｂ）能识别简并顺序的，如：AvaI
AvaI 5’-CPyCGPuG-3’
CCCGGG; C TCGGG; CCCGAG; CTCGAG
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第三章基因工程第一节基因工程工具 酶wangjx[1]
• •EcoRⅠ的识别序列
•5’- GAATTC-3’ •3’- CTTAAG -5’
2) 核酸酶H活性：除去DNA-RNA杂交分子中的 RNA分子，pH 7.6-8.5
3) 3’-磷酸酶活性：除去3’-磷酸基后形成3’-OH端， 有利于DNA聚合酶反应，pH 6.8-7.4
4) 内切酶活性：在无嘌呤或无嘧啶处将DNA键切开，
pH 7.6-8.5
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第三章基因工程第一节基因工程工具 酶wangjx[1]
pAACNNNNN3’ TTGNNNNN5’
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•HaeⅠ的识别序列和酶切切口（平端）
第三章基因工程第一节基因工程工具 酶wangjx[1]
•酶切条件：酶切缓冲液
•低盐组：0～50mmol/L NaCl •中盐组：50～100mmol/L NaCl •高盐组：100～150mmol/L NaCl
•（五）、 限制酶的用途
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第三章基因工程第一节基因工程工具 酶wangjx[1]
（一）、限制修饰系统的种类
1. I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS
（host specificity for DNA restriction modification and specificity）位于染色体上， 三个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、 Mg2+、SAM（５—腺苷甲硫氨酸），无特异切割 位点。
•OH3' •P5'
•5'P
•OH3'
•3'HO
•P5'
•5'P
•3'HO
•3'HO •P5'
•OH3' •P5'
•5'P
•OH3'
•3'HO
•P5'
•3'HO •5'P
•3'HO
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•OH3' •P5'
•3'HO •P5'
•RNaseH
•P5'
•3'HO
•P5'
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•CH3
•RE
•CH3 •RE
•人工
•接头
•RE •CH3
•与载体相连
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三、核酸酶
（一）、外切酶III（ExoIII）
1. 一般特点： 来自于E.coli，分子量28,000 kD 2. 催化反应类型
1) 外切酶活性：3’→5’，产生5’-单磷酸核苷酸和具 各种结构的 ds-DNA，pH 7.6-8.5
的形成
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２） 在建立基因文库时，可先使DNA分子部分甲基 化，然后再用限制酶切
第三章基因工程第一节基因工程工具
酶wangjx[1]
•用于基因组文库的建立
•RE
•RE
•RE•M.RE •CH3
•RE
•RE
•RE
•CH3
•RE
•RE
•RE •RE •CH3
•用于cDNA的连接
•RE
•RE •甲基 •化酶
•pAATTCNNNNNN3'
•
GNNNNNN5’
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•EcoRⅠ的识别序列和酶切切口（粘端）
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• 5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘ • 3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘
•5’NNNNNGTT •3‘NNNNNCAAp
CCGGN’N’N’N’N’CCGG Fok I 5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’
3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突起
２）富含ＧＣ
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３）对称性—双对称
EcoRI 5’-G A A T T C-3’ 3’-C T T A A G-5’
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第三章基因工程第一节基因工程工具 酶wangjx[1]
３） 平齐末端
SmaI 5’-CCCGGG-3’
5’-CCC
3’-GGGCCC-5’
3’-GGG
４）非互补的粘性末端
GGG-3’ CCC-5’
ａ）切点在识别顺序之外的，如：FokI
Fok I 5’-GGATG(Ｎ)9-3’
5’-GGATG(N)9
（二）、限制性内切酶的定义、命名
1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶； 狭
义指II型限制酶。
2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌
系编号、分离顺序。
例如：HindⅢ 前三个字母来自于菌种名称 H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型； “Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。
EcoRI—Escherichia coli RI HindⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ SacI (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)
5’-GOH 3’-CTTAAP
PAATTC-3’ HOG-5’
粘性末端能与另一个相同的粘连末端相连接，任何两个具有
相同识别位点的DNA分子经限制酶切割后能够重新连接成新的
重组DNA分子。在进行DNA重组时，应用限制酶同时切割目的
基因和载体DNA，使之产生相对的粘性末端，然后再将二者连
接成重组DNA分子
４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外
５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-Ｏ
Ｈ
2. 末端种类
１）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸
Pst I 5’-CTGCAG-3’ 5’-CTGCA
G-3’
3’-GACGTC-5’ 3’-G
ACGTC-5’
２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸
EcoRI 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’
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第三章基因工程第一节基因工程工具 酶wangjx[1]
酶切图谱的构建（b）
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第三章基因工程第一节基因工程工具 酶wangjx[1]
二、DNA甲基化酶
（一）、 甲基化酶的种类与识别顺序
1. 限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶
三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶
2. 酶切位点与识别位点不一致，切点常在识别位点
的一侧，1-- 20nt。
3. 酶切后的末端经补平后又可发生酶切反应。
4. 产生粘性末端可以是1--5个核苷酸。
5. 均为单体，分子量为47—108 kD。
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第三章基因工程第一节基因工程工具 酶wangjx[1]
酶切图谱的构建（a）
•请构建 该环状 DNA分 子的酶 切图谱
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（四）、异源同序酶 （isoschizomer，同裂酶）
1. 定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多
种限制 酶
2. 特点：1）识别相同顺序
2）切割位点的异同
KpnI GGTAC C
Asp718 G GTACC
SstI CCGC GG
2. 核酸酶S7，亦称微球菌核酸酶，对RNA敏感，用于除去
蛋白质合成系统中的内源mRNA
（三）、RNase H
作用于DNA-RNA杂交分子中的RNA链，用于cDNA文 库建立时除去RNA链以便第二条链cDNA链的合成。
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第三章基因工程第一节基因工程工具 酶wangjx[1]
3. 外切酶活性特点
1) 反应底物：互补ds-DNA 2) 碱基释放速度：C>>A-T>>G 3) 反应产物：5’-单磷酸核苷和具缺口或5’-端突起的 ds-DNA，过度反应将导致DNA降解
4. 用途
1) 核酸（DNA）标记 2) 基因突变----缺失 3) DNA序列测定时作顺序缺失 5. 使用注意事项 1) 正式使用前，测定在一定条件下酶的反应速度 2) 在一定条件下，ExoIII不能作用GC富集区(来自 于cDNA加尾)
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2. II型甲基化酶对限制酶活性的影响
１） 抑制同种限制酶的活性
M.BamHI GGATmCC—BamHI(GGATCC)
M.EcoRI GAmATTC—EcoRI(GAATTC)
２） 抑制不同种限制酶的活性
a. 顺序完全重叠 如：M. ClaI（ATCGmAT）----TaqI （TCGmA）
SacI CCGC GG
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第三章基因工程第一节基因工程工具 酶wangjx[1]
（五）、 限制酶的用途
1. DNA重组 2. 限制酶（物理）图谱绘制
3. 突变分析（RFLP分析）
4. 限制酶的部分酶切与完全酶切
附：IIS型限制酶的特点
1. 具有特异型核苷酸顺序识别能力，但该顺序不具
有对称结构。
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第三章基因工程第一节基因工程工具 酶wangjx[1]
•ds-DNA结构: 切口, 缺口, 断口
•3'HO P5'
•3'HO P5'
•缺口(gap)
切口(nick)
断口(cut)
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第三章基因工程第一节基因工程工具 酶wangjx[1]
•5'P •3'HO
•ExoIII的外切酶和RNaseH的作用
•ExoIII用于顺序缺失
•1 2 3 4 a b c
• 34abc
•
4abc
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•1 2 3 4 a b c
•a b c
第三章基因工程第一节基因工程工具 酶wangjx[1]
（二）、RNase（三）、RNaseH
（二）、RNase
大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去DNA样 品或蛋白质合成系统中的RNA分子。 1. RNase A 分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂（100℃
b. 顺序边界重叠 如：M. BamHI（GGATmCC）---MepI（mCCGG）
３） 抑制不同种限制酶的部分活性
M．TaqI（TCGmA）---HindII（GTPyPuAC）：
GTCAAC，GTTAAC，GTCGmAC，GTTGAC
3. 甲基化酶的用途
１） 改变某些限制酶识别顺序的特异性，以便重组体
2. II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在Ｅ.
coli中这两种基因位于质粒上。
3. III型：修饰酶与Ｉ型酶相同，hsdＭ与hsdＳ基
因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。
上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有 相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基
因工程中。
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第三章基因工程第一节基因工程工具 酶wangjx[1]
（三）、限制酶的特点
1. 识别顺序和酶切位点
１）识别４-8个相连的核苷酸
MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC BamHI GGATCC：PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC；
SfiI GGCC N N N N N GGCC
（四）、 DNase I
1. 特点：具内切酶活性，作用于ds -DNA，但无核苷酸序列
特异型，产生5’-P低聚核苷酸; Ca2+ , Mg 2+ 或Ca2+ , Mn2+可 使酶活达最大值
•5'P •3'HO
Fra Baidu bibliotek
•OH3'
• ExoIII
•P5'
•ExoIII •用于
•DNA •标记
•3'HO •P5'
• ExoIII
•1 2 3 4 a b c
•[α-32P] •dCTP
•OH3'
•5'P
•[α-32P] •dCTP
•1 2 3 4 a b c
• 234abc
•1 2 3 4 a b c
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第三章基因工程第一节基因工程工具 酶wangjx[1]
一、限制性内切酶
•（一）、限制修饰系统的种类 •（二）、限制性内切酶的定义、命名 •（三）、限制酶的特点 •（四）、异源同序酶（isoschizomer， 同裂酶）
和腺嘌呤发生甲基化，形成5’-甲基胞嘧啶和6’-甲基腺
嘌呤。
在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与
相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制
酶作用位点可同可不同。
如：M. EcoRI GA mATTCC EcoRI G AATTC 不同
M．HpaI C mCGG
HpaI C CGG 相同
•HaeⅠ的识别序列
•5’- GTTAAC-3’ •3’- CAATTG -5’
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第三章基因工程第一节基因工程工具 酶wangjx[1]
•5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’ •3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’
•5’NNNNNG
•3’NNNNNCTTAA p
3’-CCTAC(Ｎ)13-5’
3’-CCTAC(N)13
ｂ）能识别简并顺序的，如：AvaI
AvaI 5’-CPyCGPuG-3’
CCCGGG; C TCGGG; CCCGAG; CTCGAG
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第三章基因工程第一节基因工程工具 酶wangjx[1]
• •EcoRⅠ的识别序列
•5’- GAATTC-3’ •3’- CTTAAG -5’
2) 核酸酶H活性：除去DNA-RNA杂交分子中的 RNA分子，pH 7.6-8.5
3) 3’-磷酸酶活性：除去3’-磷酸基后形成3’-OH端， 有利于DNA聚合酶反应，pH 6.8-7.4
4) 内切酶活性：在无嘌呤或无嘧啶处将DNA键切开，
pH 7.6-8.5
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pAACNNNNN3’ TTGNNNNN5’
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•HaeⅠ的识别序列和酶切切口（平端）
第三章基因工程第一节基因工程工具 酶wangjx[1]
•酶切条件：酶切缓冲液
•低盐组：0～50mmol/L NaCl •中盐组：50～100mmol/L NaCl •高盐组：100～150mmol/L NaCl
•（五）、 限制酶的用途
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第三章基因工程第一节基因工程工具 酶wangjx[1]
（一）、限制修饰系统的种类
1. I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS
（host specificity for DNA restriction modification and specificity）位于染色体上， 三个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、 Mg2+、SAM（５—腺苷甲硫氨酸），无特异切割 位点。
•OH3' •P5'
•5'P
•OH3'
•3'HO
•P5'
•5'P
•3'HO
•3'HO •P5'
•OH3' •P5'
•5'P
•OH3'
•3'HO
•P5'
•3'HO •5'P
•3'HO
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•OH3' •P5'
•3'HO •P5'
•RNaseH
•P5'
•3'HO
•P5'
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•CH3
•RE
•CH3 •RE
•人工
•接头
•RE •CH3
•与载体相连
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三、核酸酶
（一）、外切酶III（ExoIII）
1. 一般特点： 来自于E.coli，分子量28,000 kD 2. 催化反应类型
1) 外切酶活性：3’→5’，产生5’-单磷酸核苷酸和具 各种结构的 ds-DNA，pH 7.6-8.5
的形成
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２） 在建立基因文库时，可先使DNA分子部分甲基 化，然后再用限制酶切
第三章基因工程第一节基因工程工具
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•用于基因组文库的建立
•RE
•RE
•RE•M.RE •CH3
•RE
•RE
•RE
•CH3
•RE
•RE
•RE •RE •CH3
•用于cDNA的连接
•RE
•RE •甲基 •化酶
•pAATTCNNNNNN3'
•
GNNNNNN5’
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•EcoRⅠ的识别序列和酶切切口（粘端）
第三章基因工程第一节基因工程工具 酶wangjx[1]
• 5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘ • 3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘
•5’NNNNNGTT •3‘NNNNNCAAp
CCGGN’N’N’N’N’CCGG Fok I 5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’
3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突起
２）富含ＧＣ
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３）对称性—双对称
EcoRI 5’-G A A T T C-3’ 3’-C T T A A G-5’
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３） 平齐末端
SmaI 5’-CCCGGG-3’
5’-CCC
3’-GGGCCC-5’
3’-GGG
４）非互补的粘性末端
GGG-3’ CCC-5’
ａ）切点在识别顺序之外的，如：FokI
Fok I 5’-GGATG(Ｎ)9-3’
5’-GGATG(N)9
（二）、限制性内切酶的定义、命名
1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶； 狭
义指II型限制酶。
2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌
系编号、分离顺序。
例如：HindⅢ 前三个字母来自于菌种名称 H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型； “Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。
EcoRI—Escherichia coli RI HindⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ SacI (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)
5’-GOH 3’-CTTAAP
PAATTC-3’ HOG-5’
粘性末端能与另一个相同的粘连末端相连接，任何两个具有
相同识别位点的DNA分子经限制酶切割后能够重新连接成新的
重组DNA分子。在进行DNA重组时，应用限制酶同时切割目的
基因和载体DNA，使之产生相对的粘性末端，然后再将二者连
接成重组DNA分子
４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外
５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-Ｏ
Ｈ
2. 末端种类
１）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸
Pst I 5’-CTGCAG-3’ 5’-CTGCA
G-3’
3’-GACGTC-5’ 3’-G
ACGTC-5’
２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸
EcoRI 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’
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酶切图谱的构建（b）
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二、DNA甲基化酶
（一）、 甲基化酶的种类与识别顺序
1. 限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶
三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶
2. 酶切位点与识别位点不一致，切点常在识别位点
的一侧，1-- 20nt。
3. 酶切后的末端经补平后又可发生酶切反应。
4. 产生粘性末端可以是1--5个核苷酸。
5. 均为单体，分子量为47—108 kD。
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第三章基因工程第一节基因工程工具 酶wangjx[1]
酶切图谱的构建（a）
•请构建 该环状 DNA分 子的酶 切图谱
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（四）、异源同序酶 （isoschizomer，同裂酶）
1. 定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多
种限制 酶
2. 特点：1）识别相同顺序
2）切割位点的异同
KpnI GGTAC C
Asp718 G GTACC
SstI CCGC GG