Primer Express TaqMan引物探针设计
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Primer Express TaqMan引物探针设计
一、安装软件ABI公司Primer Express v3.0
Primers and Probe Design For Real-Time PCR
二、Primers/Probes Design Guideline
TaqMan Probe Primer
Probe 与Primer 的距离愈近愈好, PCR产物大小建议在50-150 bp为最佳
G/C % 为30-80 %
避免有重复序列的出现，尤其避免4个以上G的出现
Tm 值: 68-70℃ (Quantification assay) Tm 值: 58-60℃
65-67℃ (Allelic Discrimination assay)
Probe 长: Primer 长: 13~25 bases (TaqMan MGB probe) 20 bases (Optimal)
13~30 bases (TaqMan probe)
避免连续6个A的序列出现3’端的前5个序列里不能超过2个C+G
5’端第一个序列不能为G
(如果选择FAM-dye在5’端第二个序列也可以为G)
选择C比G多的strand当作probe b
避免3’端的前4个序列含有3个或以上G
(GGG-MGB-3’ or GGAG-MGB-3’) a
避免probe的中间区域含有2个或以上的CC di-nucleotides a
a. 针对TaqMan MGB探针
b. 参数可选择设定
三、Primers & Probes（Automatically Design）
①进入Primer Express 3.0软件
File→ New →选择TaqMan MGB Quantification或TaqMan Quantification → OK
②Tools →按Add DNA File，寻找序列存取位置，按下Add，将序列档案加入空白文件。亦可在Sequence的界面中使用Copy & Paste 复制和粘贴或直接输入序列。
* Primer Express Software 只能接受dan, txt, ab1,或abi的档案格式，请事先将欲分析的序列存成纯文字档即可(若序列是从database download下来时,请刪除与序列无关的资料)。
③可勾选Double Strand, 即会显示double stranded DNA sequence。
④各Tools选项操作
1. Exclude:不必要的序列可利用Exclude Selected Bases将序列划掉。- 先选取不要的序列范围，点选“Exclude”，即可看见此区域被划掉。
2. Junction: 如果已经知道序列上junction位置则可利用Junction
- 选取juction的位置(必须含2 bases)，再点选Junction，即可看见此区域被红色标记起来。
3. 在Parameters界面中可看到Primer/Probe Tm值设定及其他Primers/Probe情况。
4. 回到Sequence界面，Tools → Find Primers/Probes，软件即开始找寻找适当的Primers/Probe pairs。
*Primer Express软件会找到Candidate Primers & Probe pairs，一次search最多能找到50种组合，这些组合列与Primers / Probes界面中。中间Location说明primers & probes在序列中的相对位置，在横线上方的数字代表起始位置，橫线下方则代表终止位置。
⑤Sequence界面中会显示出与Primers / Probes界面相对应的一对Primers/Probe: 粉红色片段是Probe的位置，蓝色代表Forward Primer，黄色片段则为Reverse Primer，如下图所示。(*但并不表示此为最佳的设计)。
⑥在Primers / Probes界面中会将每对Primers/Probe的组合列出来，请从中挑选出适当的组合，挑选方式可依据之前的primer/ probe design guideline。在MGB Probe的筛选中, 亦在Parameters 界面中加选C比G多的序列作为进一步筛选的参数。
⑦決定primer/probe set之后则可进行存档，存档的方式从File → Save As存档。如果想将所选择的primer/probe set单独储存, 可利用Export→Order Info…的方式，或者要储存50个Primers /Probes清单，可点选Expor t→Primers/Probes List…，以上两种方式都可存成txt档案，在Excel 中开启。