干血滤纸片

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实验方案一步骤
a.取直径约3mm的干血滤纸片剪碎置于1.5ml的离心管内； b.加纯水400ul，高速震荡5-10s，室温浸泡20min，使滤纸沉 淀； c. 13000r/min离心3min，弃上清； d.加入5%chelex-100溶液100ul及20mg/ml的蛋白酶K溶液4ul， 56℃孵育30min以上； e.高速震荡5-10s，放入100 ℃孵育8min，震荡5-10s； f.13000r/min离心3min，直接取上清为模板。
实验方案二
a.将3mm的干血滤纸片放入0.5mlEppendorf管中; b.加入新鲜配制的甲醇/丙酮混合液10ul; c.65℃真空抽干,以此为模板。 c.65 ,
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实验方案三
a.取直径约1cm的滤纸干血滴置于1.5mlEppendorf管内; b.加600ul生理盐水溶血，室温置15min，轻摇并弃溶血液; c.加600ul双蒸去离子水洗涤，弃洗涤液; c. 600ul ; d.加100ul双蒸去离子水煮15min，离心15min，取上清为模板
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实验方案四
a.将滤纸经（20mmol/L Tris*HCl pH8.8，2mmol/L EDTA, 0.5%
Triton X-100, 0.1% SDS）2分钟使饱和后； b.放入37℃孵箱中干燥处理后，滴上血滴制成干血滤纸片， 直接作为模板。
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方案一 步骤（其他）
1. 全血 1) 取3～10μl全血加到0.5ml离心管中，加人500μl纯水，剧烈 振荡，室温下放置15分钟。 2) 13,000rpm离心3分钟，去上清，收集沉淀。（必要时可用 蒸馏水反复洗沉淀物，直至无色或血色素很少）。 3) 沉淀中加入200μl 5％ Chelex-100溶液（5％ Chelex-100为 悬浊液，使用前要充分振摇，使Chelex-100颗粒悬浮），在振荡 Chelex-100 器上反复振荡，放入56℃保温30分钟以上。 4) 取出后振荡，100℃保温8分钟，振荡后，13,000rpm离心3 分钟，上清用于PCR扩增，或放4℃保存备用。 2． 血斑 1) 剪取约0.5cm2的血斑，加到0.5ml的离心管中，加入500μl 纯水，剧烈振荡，室温放置15分钟。13,000离心3分钟，去上清 。（可用纯水反复洗至无色，载体不需去除，始终留在离心管中 。） 2) 以下步骤同全血的提取方法。 Slide No. 7
实验试剂及仪器
• 实验试剂：
新鲜配制的甲醇/丙酮混合液（体积分数为1） 生理盐水 5%chelex-100溶液 20mg/ml的蛋白酶K Taq酶，dNTPs，10X Taq酶 buffer，随机引物
• 实验仪器 真空干燥泵，离心机，温箱
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方案一Chelex-100法提取
一、 原理 当检材较少时或者基因分型只需要少量的DNA时，可以用Chelex-100提取方法 提取DNA。Chelex-100是一种化学整合树脂，由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成。含有成 对的亚氨基二乙酸盐离子，整合多价金属离子，尤其是选择性整合二价离子，比普通 离子交换剂具有更高的金属离子选择性和较强的结合力．能结合许多可能影响一步分 析的其他外源物质。通过离心除去Chelex-100颗粒，使这些与Chelex-100结合的物质与 DNA分离，防止结合到Chelex中的抑制剂或杂质带到PCR反应中，影响下一步的DNA分 析，并通过结合金属离子，防止DNA降解。 二、仪器设备 干热器、恒温水浴箱、高速离心机、离心机 三、试剂 Chelex-100法提取生物检材所需试剂的配制 1． 5％ Chelex-100 （w/v） 称取5克Chelex-100，加100ml灭菌纯水，放4℃保存。 2． 10％ SDS 称取10克优级纯的SDS，加纯水到100ml溶解，室温保存。 3． 5mg/ml PK酶（蛋白酶K） 称取5mg PK酶，溶于1ml灭菌纯水中，－20℃保存。 4． 1M DTT (二硫苏糖醇) 称取154.3mg DTT加1ml灭菌纯水溶解，－20℃保存。
干血滤纸片法基因诊断实验
李禄慧
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实验目的
• 直接采用干血滤纸片中保存的血液样本为 PCR扩增的模板，进行基因诊断。
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实验意义
• 干血滤纸片具有用血量少，保存简单，易 于运输等特点。所以应用干血滤纸片作为 基因诊断的模板具有非常重要的意义。
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