RhoC在肝癌细胞生长中的作用及分子机制

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３个重复孔。以时间为横轴、Ａ值为纵轴，绘制细胞生长曲线。

４．硝酸银染色检测细胞增殖：将各组细胞按２×１０４个／孔的数量分别接种于含盖玻片的２４孔培养板中，置３７℃、５％ＣＯ：孵箱培养，待细胞长成单层，９５％乙醇固定。将细胞铺片浸入去离子水中，使其水化。向细胞铺片上滴加应用染色液，室温下染色Ｉｈ。用去离子水反复冲洗，９５％一１００％系列酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下计数细胞核内散在大小不等的黑色颗粒。

５．细胞平板克隆形成实验：在培养瓶中将处于对数生长期的ＲＮ舡组、空白对照组和阴性对照组细胞用０．２５％胰酶消化，在高糖一达尔伯克改良伊格尔培养基（Ｈ—ＤＭＥＭ）培养液中吹打成单个细胞悬液。将细胞以３００个／孔的密度接种于６孔板，每孔加含１０％胎牛血清的Ｈ—ＤＭＥＭ培养液３ｍｌ；每组细胞设３个重复孔。以十字方向轻轻晃动培养板，使细胞分散均匀。将培养板放入３７℃、５％ＣＯ：培养箱中孵育，静止培养２周。弃去培养液，用ＰＢＳ（Ｏ．０１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．４）小心浸洗２次。每孔加３ｍｌ纯甲醇固定１５ｒａｉｎ。弃去固定液，每孔加２ｍｌ姬姆萨染液染色３０ｍｉｎ，然后流水缓慢洗去染色液，空气中干燥。在显微镜下计数＞５０个细胞的克隆数。克隆形成率＝克隆数／接种细胞数（３００）×１００％。

６．流式细胞术（ＦＡＣＳ）检测细胞周期：收集６孔板中处于旺盛生长期的各组细胞，７０％乙醇４０ｃ固定过夜。上机检测前ＰＢＳ洗细胞３次，加ＲｎａｓｅＡ，３７℃作用３０ｍｉｎ，然后加入碘化丙啶染色３０ｍｉｎ。每组设３个重复孔。

７．ＲＴ—ＰＣＲ检测细胞周期蛋白及其相关蛋白表达：ｃｙｃｌｉｎＤ１：上游引物５’－ＴＧＧＡＴＣ，Ｃ＇ＩＷ沁ＡＧＧ－贰瓢ＣＧＡＧ－３’，下游引物５＇－ＧＧＣＴＩＥＧＡＴＣＩｒ．Ｃｒ－ＣＣｒＧＧＣ－３’．退火温度６２℃；ＣＤＫ４：上游引物５’・ＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＡ删Ａ－３’，下游引物５’一ＴＣＧＡＧＧＣＣＡＧＴＣＧＴＣＴｒＬ＇ＴＧ－３’，退火温度５８℃；ｐ１６：上游引物５＇－ＣＣＴＣＣＧＧＡＡＡＣＴｒＡＧＡＴＣＡＴＣ－ＡＧＴＣＡ－３’，下游引物５’．ｃＣＣＣＴＧＡＧＩ丑１℃ＣＣｒＡＧＴ］＇ＣＡＣＡＡ－３’，退火温度６ｌ℃；ｐ２ｌ：上游引物５’－ＡＧＣＴＣＡＡＴＧＧ，ＡＣＴＧＧＡＡＣ，ＧＣ，－３’，下游引物５７一ＧＡＧＣＴＣ七ＡＡＧＧＴＧＴｌ３Ｗ，ＧＣ，Ｃｒ３’，退火温度５２℃。待检基因扩增３０个循环，内参照基因扩增２５个循环。

８．ＲｈｏＣ高表达ＨＬ７７０２细胞稳定克隆的筛选及鉴定方法：采用脂质体法将质粒ＰｃＤＮＡ３一ＲｈｏＣ（吉林大学第一医院普外科实验室留存）转染正常人肝细胞ＨＬ７７０２，空质粒转染作为对照，６００ｍｇ／Ｌ浓度的Ｇ４１８筛选稳定转染细胞克隆，以ＲＴ・ＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法鉴定ＲＩｌ０Ｃ基因表达水平。上游引物：５’．ＡＴ（；ｏｃＴＧｃＡＡｌＩＣＣＧＡＡＡＧＡＡＧ－３’；下游引物：５＇－ＴＣＡＧＡＧＡＡＴＧＧＧＡＣＡＧＣＣＣＣＴ．３’。

９．ＭＴｒ法检测转染ＲｈｏＣ基因后肝细胞ＨＬ７７０２增殖能力的改变：ＰｃＤＮＡ３一Ｒｈｏｃ稳定转染组、ＰｃＤＮＡ３空质粒转染组和空白对照组细胞以２０００个／孔的密度接种于９６孔板，体积２００讪／孔，其余操作步骤同方法３。

１０．统计学方法：采用ｓＰｓｓ１３．０软件统计分析。实验数据用均数±标准差（孟±ｓ）表示，两组间比较采用ｔ检验，检验水准俚＝０．０５。

结果

１．ｓｉＲＮＡ．ＲｈｏＣ载体的构建：空载体ｐＵ６ｍＲＦＰ用ＫｐｎＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切后得到２条电泳带，长度与预期结果相符（３６３ｂｐ）；重组质粒ｓｉＲＮＡ—ＲｈｏＣ和ｓｉＲＮＡ—ｓｃｒａｍｂｌｅ因ＨｉｎｄⅢ位点在连接过程中被插入失活，故用ＫｐｎＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切后只有１条电泳带，表明合成的ｓｉＲＮＡ—ＲｈｏＣ片段和ｓｉＲＮＡ．ｓｃｒａｍｂｌｅ片段退火后，均与经ＫｐｎＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切的ｐＵ６ｍＲＦＰ载体连接成功，构成ｐＵ６ｍＲＦＰｓｉＲＮＡ．ＲｈｏＣ和ｐＵ６ｍＲＦＰｓｉＲＮＡ—ｓｃｒａｍｂｌｅ质粒。测序结果证实，ｐＵ６ｍＲＦＰ载体中的插入片段与设计的干扰序列完全一致。

２．ＲｈｏＣ基因沉默肝癌细胞稳定转染克隆的筛选与鉴定：经抗生素Ｇ４１８筛选，ｐＵ６ｍＲＦＰｓｉＲＮＡ—ＲｈｏＣ和ｐＵ６ｍＲＦＰｓｉＲＮＡ．ｓｃｒａｍｂｌｅ转染的Ｂｅｌ７４０２细胞在荧光显微镜下均显示单一的表达红色荧光蛋白的细胞。经ＲＴ－ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定，ＲｈｏＣ基因表达受到显著抑制，抑制效率分别为８２．３％和８５．１％（图１、２）。

Ｍ：分子量标记；ｌ：Ｂｅｌ７４０２细胞组；２：

阴性对照组；３：脯Ａｉ组

圈ｌ

ＲＴ－ＰＣＲ检测ＲｈｏＣ基因沉默结果

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１：Ｂｅｌ７４０２细胞组；２：阴性对照组；３：ＲＮＡｉ组

图２

Ｗｅｓｔｅｒｎ

ｂｌｏｔ检测ＲｈｏＣ基因沉默

结果

３．Ｍ

ｒｒＩ＇检测细胞生长：细胞培养的前３ｄ，各组

细胞生长速度差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。到第４天，ＲＮＡｉ组Ａ值为０．４１±０．１０，显著低于Ｂｅｌ７４０２细胞组（０．７３±０．１１，Ｐ＜０．０５）和阴性对照组（０．７１±０．０７，Ｐ＜０．０５）。此后，ＲＮＡｉ组的细胞增殖速度持续低于Ｂｅｌ７４０２细胞组和阴性对照组，直到第７天实验结束，表明基因沉默ＲｈｏＣ可导致肿瘤细胞增殖速度减慢（图３）。Ｂｅｌ７４０２细胞组和阴性对照组在各时间点上相差均不显著（Ｐ＞０．０５）。

图３各组细胞的生长曲线

４．硝酸银染色检测细胞增殖：ＲＮＡｉ组与对照组相比，细胞核银染颗粒着色浅，平均每个细胞染色颗粒数ＲＮＡｉ组（１．２３±０．３５）显著低于Ｂｅｌ７４０２细胞组（３．４７±Ｏ．９３，Ｐ＜０．０１）和阴性对照组（３．１７±０．７８，Ｐ＜０．０１），表明沉默ＲｈｏＣ基因导致细胞增殖

能力减弱（图４）。

５．细胞平板克隆形成实验：肉眼可见，ＲＮＡｉ组细胞形成平板克隆数量稀少，而两对照组形成克隆数量明显增多。镜下计数结果显示，ＲＮＡｉ组的细胞克隆形成数量和克隆形成率分别为（６０．７５±１６．４６）

个／孔和（２０．３３±５．４２）％，均显著低于对照组［（２０９．５０±４４．３１）／？、／孑Ｌ和（６９．８３±１４．７７）％，Ｐ＜

０．０１］及Ｂｅｌ７４０２细胞组［（２１１．７５±３０．２７）爪／孔和（７０．５８４－１０．１０）％，Ｐ＜０．０１］，表明沉默ＲｈｏＣ基因可显著抑制肿瘤细胞克隆形成能力。

６．ＦＡＣＳ检测细胞生长周期的改变：ＲＮＡｉ组Ｇｏ／Ｇ，期细胞百分率为（７３．１４±５．９３）％，明显高于Ｂｅｌ７４０２细胞组［（５７．０５±５．９７）％，Ｐ＜０．０５］和阴性对照组［（５２．９９±４．８０）％，Ｐ＜０．０５］，两对照组差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）；ＲＮＡｉ组Ｇ：／Ｓ期细胞百分率为（２４．８６４－３．６６）％明显低于Ｂｅｌ７４０２细胞组［（３８．８１±３．７７）％，Ｐ＜０．０１］和阴性对照组［（４７．００±４．８０）％，Ｐ＜０．０１］，两对照组差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。

７．ＲＴ—ＰＣＲ检测细胞周期蛋白及其相关蛋白基因的表达：ＲＮＡｉ组与Ｂｅｌ７４０２细胞组和阴性对照组相比，基因表达水平发生显著性下降的有ｃｙｃｌｉｎ

ＤＩ

（０．４５±０．２１、１．２５±０．２４、１．１２±０．１５，Ｐ＜０．０５）和ＣＤＫ４（Ｏ．５５±０．０８、１．１８±０．３２、１．１０±０．２９，Ｐ＜０．０５）；基因表达水平显著升高的有ｐ１６（１．０７±０．２３、０．３６±０．１２、０．３５±０．１３，Ｐ＜０．０１）和ｐ２１（０．４２±Ｏ．１２、０．１７±０．０６、０．１９±０．０８，Ｐ＜０．０５）；各细胞组内参照基因均表达良好（图５）。

８．ＲｈｏＣ高表达ＨＬ７７０２细胞稳定克隆的筛选及鉴定结果：ＰｃＤＮＡ３一ＲｈｏＣ质粒转染ＨＬ７７０２细胞，获得了稳定转染细胞株。转染ＲｈｏＣ的ＨＬ７７０２细胞ＲｈｏＣｍＲＮＡ水平显著高于ＨＬ７７０２细胞组和ＰｃＤＮＡ３空载体对照组（分别为１．１ｌ－＋０．２３、０．３５±０．０７和０．３４４－０．０９，均Ｐ＜０．０１；图６）。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测结果显示，ＲｈｏＣ转染组显著高于ＨＬ７７０２

图４硝酸银染色检测不同细胞组的细胞增殖结果ｘ４０

ａ：Ｂｄ７４０２细胞组；ｂ：阴性对照组；ｃ：ＲＮＡｉ组