大肠杆菌表达系统使用指导.pptx
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基因工程3大肠杆菌表达系统课件
定性。 具有核糖体结合位点； 具有强启动子；
……
基因工程3大肠杆菌表达、大肠杆菌表达载体的基本成分
RBS
R
P
编码序列
TT
tetr
Ori
TT-G35ACA。。。17。。TA-1T0AAT
ATG（91%） GTG（8%） TTG（1%）
TAAGGAGG（N）8
TAA TGA TAG
此外，转录终止子还能增强mRNA分子的稳 定性，从而大大提高蛋白质产物的水平。
基因工程3大肠杆菌表达系统
14
（3）翻译起始序列
mRNA转录本5’端的独特的结构特征（核 糖体结合位点，RBS），是决定mRNA翻译效 率的主要因素。
至今，仍未鉴定出通用有效的翻译起始序列的保 守结构，但却已经发展出许多种可以用来有效地降 低在mRNA转录本5’-末端形成二级结构的实验方 法，从而提高克隆的外源基因的表达效率。
（3）加入适量的DNA后，于42 ℃热处理90秒；
（4）将混合物快速转移到冰浴中，是细胞冷却1-2分钟， 加入适当的培养基在37 ℃培养45分钟，使细胞复苏，并表
达质粒所携带的转化基因；
（5）选择培养基培养，选择转化体。
基因工程3大肠杆菌表达系统
19
2、Hanahan转化法
1983年由Hanahan设计。它的特点是在感受态细胞 的诱导方面，除了用CaCl2和MnCl2等二价离子按一定 形式组合方式处理细胞外，还利用二甲亚砜 （DMSO）、二硫苏糖醇（DTT）和氯化六氨合高钴 等进一步处理细胞，其它方面与上法相同。
在大肠杆菌细胞质内，若蛋白质N-端为Arg、 Lys、Leu、Phe、Tyr 和Trp等残基，则其稳定 性较差；而同样条件下，若N-端为除了前述6 种氨基酸之外的其它任何一种氨基酸残基时， 其稳定性则大大提高。
……
基因工程3大肠杆菌表达、大肠杆菌表达载体的基本成分
RBS
R
P
编码序列
TT
tetr
Ori
TT-G35ACA。。。17。。TA-1T0AAT
ATG（91%） GTG（8%） TTG（1%）
TAAGGAGG（N）8
TAA TGA TAG
此外，转录终止子还能增强mRNA分子的稳 定性，从而大大提高蛋白质产物的水平。
基因工程3大肠杆菌表达系统
14
（3）翻译起始序列
mRNA转录本5’端的独特的结构特征（核 糖体结合位点，RBS），是决定mRNA翻译效 率的主要因素。
至今，仍未鉴定出通用有效的翻译起始序列的保 守结构，但却已经发展出许多种可以用来有效地降 低在mRNA转录本5’-末端形成二级结构的实验方 法，从而提高克隆的外源基因的表达效率。
（3）加入适量的DNA后，于42 ℃热处理90秒；
（4）将混合物快速转移到冰浴中，是细胞冷却1-2分钟， 加入适当的培养基在37 ℃培养45分钟，使细胞复苏，并表
达质粒所携带的转化基因；
（5）选择培养基培养，选择转化体。
基因工程3大肠杆菌表达系统
19
2、Hanahan转化法
1983年由Hanahan设计。它的特点是在感受态细胞 的诱导方面，除了用CaCl2和MnCl2等二价离子按一定 形式组合方式处理细胞外，还利用二甲亚砜 （DMSO）、二硫苏糖醇（DTT）和氯化六氨合高钴 等进一步处理细胞，其它方面与上法相同。
在大肠杆菌细胞质内，若蛋白质N-端为Arg、 Lys、Leu、Phe、Tyr 和Trp等残基，则其稳定 性较差；而同样条件下，若N-端为除了前述6 种氨基酸之外的其它任何一种氨基酸残基时， 其稳定性则大大提高。
大肠杆菌表达系统PPT教学课件(1)
RNA
聚合酶
lacI
Plac
lacO
基底水平转录
lacZ lacY lacA
RNA
聚合酶
lacI
Plac
lacO
高效转录
lacZ lacY lacA
IPTG
mRNA
Tac 表达系统
tac 启动子是由 trp 的 –35 序列和 lacUV5 的 –10 序列拼接而成的杂 合启动子。
启动子 P lac P trp P tac
-35 区序列 TTTACA TTGACA TTGACA
-10 区序列 V5 相似，但 mRNA 转录水平更高于 trp 和 lacUV5 启动子（P tac = 3 P trp = 11 P lac），因此在要求有较高基因表达 水平的情况下，选用 tac 启动子比用 lacUV5 启动子更优越。
具有多顺反子结构，基因排列次序为： 启动子（lacP）- 操纵基因（lacO） - 结构基因（lacZ-lacY-lacA） 正调节因子 CAP 负调节因子 lac I
Lac 表达系统
正调节因子 CAP
cAMP激活CAP，CAP–cAMP复合物与 lac 操纵子上专一位点结合
后，能促进 RNA 聚合酶与 –35、–10 序列的结合，进而促进 Plac
外源基因在大肠杆菌中的表达
外源基因在大肠杆菌中的表达
大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
大肠杆菌表达外源基因的优势 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
外源基因在大肠杆菌中的表达
大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
一些国家规定在生产人用重组蛋白质的生产工艺中不能使用 IPTG
1-大肠杆菌表达体系介绍PPT课件
转录水平 翻译水平
质粒拷贝数
.
17
启动子
启动子 P lac P trp P tac P traA P lL P recA
-35 区序列 TTTACA TTGACA TTGACA TAGACA TTGACA TTGATA
P tac = 3 P trp = 11 P lac
.
-10 区序列 TATAAT T TAA C T TATAAT TAAT G T GATACT TATAAT
酸性国内国外均 有，中性国内尚 未产业化
稳步增长
稳步增长，当前是纺织 酶中市场最大
宽温宽pH 碱性条件 近中性
国外有，国内目 前江南大学产业 化初步阶段
稳步增长 >3000吨
诺维信等少数国 际公司产业化， 国内产业化初步 阶段
市场空间较大 > 5000吨
目前尚无商业化， 未来皂洗、染料废水脱
成本高
色市场空间大
易操作性
• 转化，筛选、遗传稳定
可延展性
• 蛋白种类，放大
低成本性
• 发酵原料，发酵工艺和后处理
高效表达
• 副产物少，表达量高
.
11
常用工业酶表达系统的表达水平
种类 细菌 酵母
丝状真菌
菌名
大肠杆菌 枯草芽孢杆菌
毕赤酵母 黑曲霉 米曲霉
里氏木霉 金孢子菌C1
表达水平
目的蛋白
总蛋白
<7g/l
20g/l
Aspergillus niger/oryzae
.
9
表达系统
工业生产：菌株、发酵工艺和后提取方法等
The good production strain is not everything, but everything is nothing without a good production strain.
大肠杆菌表达系统ppt课件
14
启动子
Trp 表达系统
以大肠杆菌 trp 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统
转录调控机理 色氨酸启动子 Ptrp 受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底 状态。
在培养系统中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA）， 便可有 效地解除阻遏抑制作用。
在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸是困难的，因此基因工程中 往往添加 IAA 诱导 Ptrp 介导的目的基因表达
化学诱导型 温度诱导型 双质粒系统
T7 启动子
目的子 T7 RNA 聚合酶基因
23
T7 表达系统
转录调控的机理 化学诱导型 噬菌体 DE3 是 l 噬菌体的衍生
株，一段含有 lacI、lacUV5 启
动子和 T7 RNA 聚合酶基因的 DNA 片段被插入其 int 基因中
28
其他表达系统
糖原调控型 采用的有大肠杆菌半乳糖转移系统（mglBAEC) mgl 启动子或沙门 氏菌阿拉伯糖基因 araB 启动子构建表达载体。 这两个启动子受葡萄糖抑制，岩藻糖和阿拉伯糖是它们的诱导物。 其调控机理类似于 Lac 表达系统.
29
其他表达系统
pH调控型 采用大肠杆菌赖氨酸脱羧酶基因 cadA 启动子构建表达载体。 cadA 启动子受培养基中 H+ 浓度，即 pH 值调控。（在pH﹥8 时抑 制，pH ﹤ 6时激活，pH = 6时转录活力最高）。 该表达系统要求菌体发酵温度控制在 27 ～30℃ 之间才能使目的基 因得到稳定的表达.
cAMP激活CAP，CAP–cAMP复合物与 lac 操纵子上专一位点结合
后，能促进 RNA 聚合酶与 –35、–10 序列的结合，进而促进 Plac
介导的转录。
基因工程中使用的 lac 启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即 Plac UV5
启动子
Trp 表达系统
以大肠杆菌 trp 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统
转录调控机理 色氨酸启动子 Ptrp 受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底 状态。
在培养系统中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA）， 便可有 效地解除阻遏抑制作用。
在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸是困难的，因此基因工程中 往往添加 IAA 诱导 Ptrp 介导的目的基因表达
化学诱导型 温度诱导型 双质粒系统
T7 启动子
目的子 T7 RNA 聚合酶基因
23
T7 表达系统
转录调控的机理 化学诱导型 噬菌体 DE3 是 l 噬菌体的衍生
株，一段含有 lacI、lacUV5 启
动子和 T7 RNA 聚合酶基因的 DNA 片段被插入其 int 基因中
28
其他表达系统
糖原调控型 采用的有大肠杆菌半乳糖转移系统（mglBAEC) mgl 启动子或沙门 氏菌阿拉伯糖基因 araB 启动子构建表达载体。 这两个启动子受葡萄糖抑制，岩藻糖和阿拉伯糖是它们的诱导物。 其调控机理类似于 Lac 表达系统.
29
其他表达系统
pH调控型 采用大肠杆菌赖氨酸脱羧酶基因 cadA 启动子构建表达载体。 cadA 启动子受培养基中 H+ 浓度，即 pH 值调控。（在pH﹥8 时抑 制，pH ﹤ 6时激活，pH = 6时转录活力最高）。 该表达系统要求菌体发酵温度控制在 27 ～30℃ 之间才能使目的基 因得到稳定的表达.
cAMP激活CAP，CAP–cAMP复合物与 lac 操纵子上专一位点结合
后，能促进 RNA 聚合酶与 –35、–10 序列的结合，进而促进 Plac
介导的转录。
基因工程中使用的 lac 启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即 Plac UV5
最新【生物课件】第六章 真核基因在大肠杆菌中的表达讲学课件
通过蔗糖梯度离心将微细胞与 正常细胞分开，含有质粒载体的 微细胞是适于检测重组子质粒所 携带的外源基因表达状况的理想 体系。
Example:
ColE1的衍生质粒（缺失了106dal）,
在微细胞中不能合成出56 103dal、 42 103dal、30 103dal、 28 103dal四 种多肽。其中3种多肽是大肠杆菌E1的降解 产物。当一段含有EcoR1甲基化酶的DNA 片断插入到卡那霉素基因内部时，便能在 微细胞中合成EcoR1甲基化酶和另外2种其 它的多肽分子。
大肠杆菌格外偏爱使用终止子UAA， 尤其是在其后加上U形成UAAU四联 核苷酸的情况下，转译终止的效率 便会得到进一步的增强。
功能启动子的分离：
一般程序：
1. 选用一种适当的核酸内切酶，消化切 割大肠杆菌的染色体DNA，
2. 接着将切割产生的DNA限制片断群体， 同一种无启动子的质粒载体重组，按 实验设计要求使克隆的片断恰好插入 在紧邻报告基因的上游位置
巨细胞检测法
1. 经紫外线照射的大肠杆菌recA uvrA细 胞，DNA停止合成，而质粒载体则可以 继续合成，在紫外线照射后6小时，细 胞内质粒DNA的数量增加了10倍左右， 在紫外线照射后的几个小时内，加入经 放射性标记的氨基酸，此时合成的蛋白 质绝大部分是质粒基因所编码的。
2. 将含有外源基因的λ噬菌体重 组子，感染到事先经过紫外线严格 照射的大肠杆菌细胞上。由于细胞 经紫外线照射使DNA受到了损伤， 自身基因的表达受到了严重的抑制。 通过同λ噬菌体载体编码的蛋白质 种类作比较，就可以鉴定出克隆基 因编码的蛋白质产物。
3. 转译起始序列
5’-末端结构特征，决定mRNA的转 译起始效率。
在核糖体结合位点（RBS）的序列 结构中，增加腺嘌呤和胸腺嘧啶脱 氧核苷残基含量的比例，诱发碱基 发生定点突变；或使用转译偶联系 统进行克隆基因表达
大肠杆菌表达系统课件
THANKS
感谢观看
3
使用表达优化后的载体，提高表达效率
改进方案提出与实施效果评估
01
02
03
优化培养条件和诱导策 略
调整诱导剂浓度、诱导 时间和温度等参数
使用分阶段诱导策略， 降低蛋白表达速度，促
进正确折叠
改进方案提出与实施效果评估
01
引入伴侣蛋白和辅助因子
02
共表达伴侣蛋白，促进蛋白正确折叠和组装
03
添加辅助因子，提高蛋白稳定性和溶解度
大肠杆菌表达系统实例分析
成功案例展示及经验分享
案例一：高效表达目 标蛋白
优化诱导条件和培养 参数
选择强启动子和合适 载体
成功案例展示及经验分享
目标蛋白表达量高，纯度高 案例二：实现复杂蛋白表达
利用伴侣蛋白和辅助因子
成功案例展示及经验分享
调整诱导时间和温度 成功表达具有生物活性的复杂蛋白
失败案例剖析及原因探讨
学Hale Waihona Puke 实践操作指点实验前准备指点学生熟悉实验器材、 试剂和操作方法，确保实 验顺利进行。
实践操作注意事项
强调实验过程中的安全、 卫生和规范操作，避免误 操作导致实验失败或影响 实验结果。
数据记录与分析
指点学生记录实验数据， 学会分析和解读实验结果 ，培养科学思维和实验技 能。
问题解答与互动讨论
实验原理解答
优化培养温度和时间
降低培养温度、延长培养时间有助于蛋白正确折叠。
改进纯化流程提高效率
选择合适纯化方法
根据蛋白性质选择亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方 法组合使用。
优化纯化条件
调整洗脱液成分、pH值及盐浓度等条件，提高纯化效果。
真核基因在大肠杆菌中的表达ppt课件
cDNA，并连接到合适的载体上，可以克服内含子问题。 ✓ 如果知道蛋白质的氨基酸序ห้องสมุดไป่ตู้，且分子量不太大，可以
用化学方法合成不含内含子序列的寡聚核苷酸片断。 ✓ 对于细菌中能降解真核蛋白的蛋白酶，可以通过突变的
方法消除。
8
真核基因在大肠杆菌中表达存在许多障碍
许多真核基因的蛋白质产物存在翻译后的修饰过程：磷酸 化、糖基化等，大肠杆菌中无此过程，因此，表达的蛋白 无法正确折叠，由此产生的三级结构通常是不可溶的，常 形成包涵体，无活性。
✓ 条件：需要信号肽的引导，使表达蛋白由细胞内膜转 运到周质。
信号肽：有原核的信号肽，也有真核的信号肽。
39
✓ 蛋白转运过程相当复杂 蛋白质跨膜过程还与细胞的结构特征有关。 即使存在信号肽，也不能保证蛋白正确转运到周质中。
如：免疫球蛋白与T-细胞受体分子结构相似。 免疫球蛋白可以在周质中表达。 T-细胞受体不能在周质中表达。
3
第一节 真核基因的大肠杆菌表达体系
4
1. 大肠杆菌表达体系
基因工程的重要目标
制备大量纯化的蛋白质产物 因此，要选择能高水平表达异源真核蛋白的表达系统
目前常用的表达系统
细菌（大肠杆菌）、酵母、昆虫细胞、植物和哺乳动 物细胞等
5
大肠杆菌表达系统的优越性
➢ 背景清楚，特别是对其基因工程表达调控的分子机理研究 的比较深入。
pBR2332 ori
32
第三节 真核基因在大肠杆菌中的表达
33
1. 外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位
细胞质中表达：易形成包涵体
✓ 包涵体：由不可溶性蛋白聚集折叠形成，是外源基因高 效表达时常发生的一种特殊生理现象。
✓ 包涵体形成的理化参数：对E. coli 80种蛋白研究获得。 电荷的平均数、形成转角的氨基酸残基的组分、半胱氨 酸的组分、脯氨酸的组分、亲水性和氨基酸残基的总数。
用化学方法合成不含内含子序列的寡聚核苷酸片断。 ✓ 对于细菌中能降解真核蛋白的蛋白酶，可以通过突变的
方法消除。
8
真核基因在大肠杆菌中表达存在许多障碍
许多真核基因的蛋白质产物存在翻译后的修饰过程：磷酸 化、糖基化等，大肠杆菌中无此过程，因此，表达的蛋白 无法正确折叠，由此产生的三级结构通常是不可溶的，常 形成包涵体，无活性。
✓ 条件：需要信号肽的引导，使表达蛋白由细胞内膜转 运到周质。
信号肽：有原核的信号肽，也有真核的信号肽。
39
✓ 蛋白转运过程相当复杂 蛋白质跨膜过程还与细胞的结构特征有关。 即使存在信号肽，也不能保证蛋白正确转运到周质中。
如：免疫球蛋白与T-细胞受体分子结构相似。 免疫球蛋白可以在周质中表达。 T-细胞受体不能在周质中表达。
3
第一节 真核基因的大肠杆菌表达体系
4
1. 大肠杆菌表达体系
基因工程的重要目标
制备大量纯化的蛋白质产物 因此，要选择能高水平表达异源真核蛋白的表达系统
目前常用的表达系统
细菌（大肠杆菌）、酵母、昆虫细胞、植物和哺乳动 物细胞等
5
大肠杆菌表达系统的优越性
➢ 背景清楚，特别是对其基因工程表达调控的分子机理研究 的比较深入。
pBR2332 ori
32
第三节 真核基因在大肠杆菌中的表达
33
1. 外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位
细胞质中表达：易形成包涵体
✓ 包涵体：由不可溶性蛋白聚集折叠形成，是外源基因高 效表达时常发生的一种特殊生理现象。
✓ 包涵体形成的理化参数：对E. coli 80种蛋白研究获得。 电荷的平均数、形成转角的氨基酸残基的组分、半胱氨 酸的组分、脯氨酸的组分、亲水性和氨基酸残基的总数。
第五章 外源基因在大肠杆菌中的表达 PPT课件
细胞质中表达的优点：
1. 形成包涵体：
a.蛋白质易于以高纯度和高浓度方式分离；
b.蛋白质受保护而免受胞内酶的降解作用；
c.蛋白质没有活性，因此不会使寄主细胞受 伤害。
2. 蛋白质的产量高。
二硫键的断裂以及转译修饰作用的丧 失，会导致外源片断编码的蛋白质在大 肠杆菌中超量表达。
3. 表达的质粒载体构建比较简单。
是负责λ DNA分子转录的启动子之一。PL启 动子是可以被E. coli RNA聚合酶所识别的强 启动子，转而转录噬菌体DNA。该启动子可 以被λcI基因产物所抑制。携带PL启动子的载 体使用温度敏感的E. coli cI突变体。在较低 的温度下，突变体所产生的cI蛋白可以抑制 PL启动子，在较高的温度下，蛋白失活可以导 致克隆基因的转录。
核糖体结合位点
启动子 转录终止子
复制 起点
1.启动子：
最佳启动子具备的条件：
第一 必须是强启动子，能够克隆基因的蛋白质产物 的表达量占细胞总蛋白的10%-30%以上； 第二 这个启动子应能呈现出一种低限的基础转录水 平，因为在表达毒性蛋白质或是有损于寄主细胞生长 的蛋白质的情况下，使用高度抑制型的启动子是一种 极为重要的条件； 第三 这种启动子应是诱导型的，能通过简单的方式 使用廉价的诱导物而得以诱导。
无启动子的CAT质粒载体
Ecoli DNA
CAT活性的检测： 氯霉素乙酰转移酶 可以催化氯霉素（2-或3-） 发 乙酰辅酶A
利用CAT基因 进行功能启动子 的分离和活性测定
薄层层析 放射自显影
三、常用的大肠杆菌表达载体
1. Lac启动子的表达载体 2. Trp启动子的表达载体 3. PL启动子的表达载体
大肠杆菌表达系统详细表格课件
整合载体
整合载体的特点
整合载体可将外源基因整合到宿 主细胞的染色体上，实现稳定遗
传。
应用范围
整合载体适用于基因治疗、基因 组编辑等领域，可提高外源基因
在宿主细胞内的稳定性。
注意事项
整合载体的构建需谨慎选择整合 位点，以避免对宿主细胞基因组
造成不良影响。
噬菌体载体
噬菌体载体的特点
噬菌体载体利用噬菌体感染宿主细胞，将外源基 因表达于噬菌体表面。
宿主菌的基因改造与优化
01
02
03
04
基因敲除
去除不必要或有害的基因，提 高表达效率和稳定性。
基因定点突变
通过改变基因序列以改良宿主 菌的某些特性，如提高蛋白表
达量。
基因融会与串联
将多个基因串联或融会，以实 现多蛋白表达或增加蛋白表达
量。
质粒优化
改进质粒复制、拷贝数和稳定 性，提高重组蛋白的表达水平
感谢观看
。
2023
PART 04
大肠杆菌表达系统的载体 选择与构建
REPORTING
质粒载体
质粒载体的特点
注意事项
质粒载体是大肠杆菌表达系统中常用 的载体类型，具有自我复制能力强、 拷贝数高等特点。
质粒载体的构建需考虑选择合适的复 制子、挑选标记以及多克隆位点等要 素。
应用范围
质粒载体适用于克隆中到大型基因以 及基因簇，并能在宿主细胞内进行高 拷贝复制。
REPORTING
定义与特点
定义
大肠杆菌表达系统是一种利用大肠杆 菌作为宿主细胞，通过基因工程技术 将外源基因在宿主细胞内进行表达的 生物反应体系。
特点
大肠杆菌表达系统具有生长速度快、 培养成本低、易于工业化生产等优点 ，广泛应用于基因工程药物、酶制剂 、生物材料等的研发和生产。
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3.将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志进行筛选及 测序。
4.融合基因的诱导表达及表达蛋白的纯化 。
（三）融合蛋白技术的关键
• 在构建融合蛋白中，一个关键的问题是两蛋白间的接头序 列( Linker )，即连接肽。它的长度对蛋白质的折叠和稳定 性非常重要。如果接头序列太短，可能影响两蛋白高级结 构的折叠，从而相互干扰；如果接头序列太长，又涉及免 疫原性的问题，因为接头序列本身就是新的抗原。
• 另外，大量研究表明连接肽的柔性和疏水性对不扰乱蛋 白质的功能结构域是十分重要的。
• 常用的融合蛋白的载体有人血清白蛋白( Huma serum albumin， HSA) 融合蛋白、 β-半乳糖苷酶融合蛋白、 谷胱 甘肽 S-转移酶(GST) 融合蛋白以及硫氧还蛋白(Trx) 融合蛋 白等。 而人血清白蛋白( HSA) 则由于本身特殊的优点， 更适合于充当长效融合蛋白类 药物的融合载体。
（三）细胞因子重组融合蛋白
• 细胞因子重组融合蛋白是一类利用基因工程的方法将编码细胞因子和 其他有特定功能的蛋白分子基因序列连接并表达相应蛋白质融合产物。 其结构特点为将细胞因子功能活性域与其他分子的活性域融合，各组 分可发挥协同作用Байду номын сангаас使融合蛋白的生物学活性较各单体大大增强。
• 按生物学功能的不同可分为：细胞因子与抗体的融合蛋白、细胞因子 与毒素的融合蛋白、不同细胞因子的融合蛋白、 细胞因子与细胞因 子受体的融合蛋白以及细胞因子与其他分子的融合蛋白。这些兼具特 异 性与高效性的新型重组融合蛋白有些已走向临床， 在抗肿瘤、 抗 风湿病、抗 HIV感染等领域发挥作用， 为人类疾病的治疗提供新的手 段。
1、细胞因子与毒素的融合蛋白
• 在一些肿瘤细胞表面存在许多细胞因子受体， 可利用细 胞因子作为靶向载体将细胞毒素运送到肿瘤微环境以杀伤 肿瘤细胞。白喉毒素与细胞因子的重组融合蛋白便是这样 一类能直接杀伤靶细胞的免疫制剂。
2、细胞因子与细胞因 子受体的融合蛋白
• 通过将在体内发挥作用时相互依赖或者所具有的协同作用细 胞因子与细胞因子受体基因重组， 可大大促进其生物学活 性的发挥。IL- 6在肝细胞的增殖中起着增强作用。IL-6和IL6Rα(gp80)的结合使其易于和另一个受体IL-6Rβ (gpl30)结合。
人血清白蛋白融合技术具有明显 的优点，包括：HSA与目 标蛋白在胞内经蛋白翻译系统通过肽键连接， 不需额外的体 外处理；HSA表达水平较高， 融合后可以提高目的蛋白的表 达水平；HSA是一个稳定的“ 惰性” 蛋白， 融合后可以提高 目的蛋白的稳定性 ； HAS融合蛋白具有比PEG修饰的蛋白药 物更长的半衰期 。
（二）融合蛋白技术的内容
• 构建融合蛋白的基本原则是， 将第一个蛋白的终止密码子删除， 再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，以实现两个基因的共同 表达。具体步骤有：
1.进行目的基因的克隆：根据基因序列互补原则 ，设计合适的引物序 列，以cDNA为模板，利用PCR技术扩增不同的目的DNA片段。
2.在载体中进行重组：通过限制内切酶将两个DNA片段进行酶切并回 收，然后通过连接酶将两个具有相同末端酶切位点的基因片段进行 体外连接，并克隆到高表达质粒载体中，构建重组质粒。
体系选择
研究基因功能: 大肠杆菌, 裂殖酵母,昆虫细胞, CHO细胞
多肽药物生产: 大肠杆菌, 毕氏酵母, CHO细胞, 乳腺组织
疫苗: 大肠杆菌, 酵母, 大多数沿用细胞培养产物进行灭毒
单抗生产: 杂交瘤细胞 工业酶生产: 各种微生物
大肠杆菌表达载体分类
按蛋白质类型分
• 单纯表达: pJLA系列, 用NcoI/NdeI导入AUG的载体 • 融合表达: 融合各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc
• 一般来说， 3-5 个氨基酸的Linker 可满足大部分融 合蛋白的正确折叠的要求。 有人尝试在融合蛋白间加 入一段有疏水性和一定伸展性的较长肽链，如 (Gly4Ser1)，目的是将两者分开，以缓解相互干扰作用， 并获得了满意的结果。
• 但具体涉及到每种蛋白时，需具体分析。当我们构建融 合蛋白时，应多选择几种融合方式， 从中优化出理想 的连接方式。
• HSA是包含585个氨基酸残基的单链无糖基化的球形蛋白 质， 分子量65kD。它是人血浆中含量最高的单一蛋白质 (达40g/L)， 在体内有维持血液渗透压， 运输营养和其它 重要生物物质的作用。HSA本身是许多内源因子和外源药 物的载体。药物和血清白蛋白结合后。可以减少其生物利 用度， 增加在体内的半衰期至19d之久。
分泌表达: pel/ompT分泌肽
按启动子分
• lac及衍生的tac , trc, pac, rac等启动子 • lamda phage PL和PR 启动子 • T7 启动子 • T5 启动子 • ara启动子
IPTG诱导 热诱导 IPTG诱导 IPTG诱导 阿拉伯糖诱导
常用表达载体
• pJLA50X系列; pcDNAII; etc
各种融合蛋白表达载体
• Protein A • GST（glutathione S-transferase） • CBD (chitin-binding domain, BioLabs;
cellulose-binding domain, Novagen) calmodulin-binding domain, Stratagene) • MBP (maltose-binding protein) • GFP (green fluorescence protein) • Thioredoxin **帮助二硫键形成 • Dsb (periplasma enzyme DsbA, DsbC) ** 二硫键的形成与 • SUMO (small ubiquitin-related modifier) • KSI (ketosteroid isomerase) 基本上全部沉淀 可用亲和层析纯化 帮助可溶化 帮助分泌到周质
• pET系列
(T7 promoter, Novagen公司)
• pQE系列
(T5 promoter, Qiagen公司)
• pMAL系列 (周质表达, BioLabs公司)
• pGEX系列 (GST融合表达, Pharmacia公司)
• pBAD系列 (Arabinose诱导型)
•pTYB系列 (CBD融合, 可以自我切割, BioLabs)