ELLMAN试剂法测定自由巯基和二硫键

ELLMAN 试剂测定自由巯基

试验基于的原理：

5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) 5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)

5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm 没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB ）[1]。TNB 2-在412nm 有很强的吸收，可以用于对肽段的自由巯基进行定量分析[2]。

S

S NO 2

NO 2

-

OOC

-

OOC

+

SH S -S

NO 2

NO 2

-

OOC

-

OOC

+

S

DTNB TNB 2- 根据文献记载，TNB 的吸光系数在13.6*103M -cm -~14.25*103M -cm -之间[3,4]。吸光度测量的最灵敏范围在0.2-0.7之间。A=εbc ，其中A 为吸光度，ε是摩尔吸收光系数或消光系数，ε单位为升/（摩尔·厘米）[L/(mol ·cm ）]。以吸光度下限0.2来计算（吸光系数取14.15*103M -cm -），需要TNB 的浓度为c=0.2/（14.15*103LM -cm -*1cm ）=1.4*10-5mol/L (1.4*10-8mol/ml)，需要蛋白浓度为1.4*10-5mol/L*18790g/mol=0.2631g/L=0.2631mg/ml. 我们的条件可以达到这个检测限度。

ELLMAN 试剂法测定自由巯基主要的影响因素有：

1. EDTA 的适量加入有助于TNB 显色的稳定和成梯度线性关系[5]。

2. 在不同缓冲液中，TNB 的最大吸收波长略微不同，所以它们在412nm 的吸收也不

3. 同，要根据选择的缓冲液来确定[5]。另外，TNB 的分光光度法分析对SDS 很敏感[6]。

4. DTNB 随着pH 的升高，降解速度加快。在pH7.0，其降解速度为0.02%/h ，在

5.pH值8.0，其降解速度为0.2%/h,随着pH值得升高，降解速度加快，在pH 12时，

15min之内会完全降解[7,8]。

6.摩尔吸收光系数在不同的温度下不同，随温度的升高而下降[4].

试验方案

主要材料：

1.材料

PEG-G-CSF 批号：080229 浓度4.32mg/ml

G-CSF 批号：080126 浓度6.9mg/ml

10k超滤膜PALL

2.试剂

Sequencing Grade Modified Trypsin,Promega，lot#237826。20 ug/小瓶。加入20 ul

50mM NH4HCO3，pH7.8溶解，配成1 ug/ ul的酶液。

1M DTT 刘春凤提供

TFA（三氟乙酸）：TEDIA Lot# 705114

乙腈：Fisher Scientific Lot# 055848

Starter kit for MALDI-TOF MS：BRUKER DALTONICS，Lot NO

2007-208241-001(including α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid(HCCA),peptide

calibration standard,protein calibration standard I,protein calibration standard Ⅱ)

PEG肽段反相分离流动相

A液：0.1%TFA/H2O

B液：0.1%TFA/90%乙腈/H2O

3.仪器

质谱仪：BRUKER DALTONICS MALTI-TOF-TOF autoflexⅢ(厂内编号

KC2007-011)

Beckman 22R台式离心机（厂内编号AM-039）

Beckman DU-800 紫外分光光度计（厂内编号KC2007-005）

恒温循环仪：JULABO F12-ED（厂内编号KC2008-003）

反相柱：Symmetry C18 5um 300À 4.6*150mm，Lot NO 020*******，内部编号1655

高压液相仪器：，（UV/Visible Detector）

试验过程：

一、缓冲液替换

PEG-G-CSF和G-CSF进行缓冲液替换，超滤替换缓冲液为50mM NH4HCO3，pH

7.8。使用50mM NH4HCO3作为空白对照，样品用50mM NH4HCO3稀释一倍

后在DU-800 紫外分光光度计上测浓度。

PEG-G-CSF的浓度约6.29mg/ml，G-CSF的浓度约10.81mg/ml。

二、酶切处理

1）取37ul G-CSF,共400ug，加入125.5ul 50mM NH4HCO3稀释为终浓度为2mg/ml。

取63.ul PEG-G-CSF,共400ug，加入152ul 50mM NH4HCO3稀释为终浓度为

2mg/ml。

2）按质量比1：40往PEG-G-CSF中加入Trypsin 10ul，往G-CSF中加入Trypsin

10ul，同时各加入1ul 1M DTT使终浓度为5mM。另做一空白对照，往300ul 50mM

NH4HCO3中加入Trypsin 15ul。

37℃反应，开始时间为。

三、肽段反相分离

G-CSF Trypsin+DTT 反相分离

收样：

PEG-G-CSF Trypsin+DTT 反相分离

收集到之间的信号峰，交由崔文喜冻干

四、ELLMAN试剂测定自由巯基

由于收集到的PEG肽段已经是自由巯基，所以可以跳过还原二硫键这一步。

根据我们所查找到得文献，采用的参数如下：

反应缓冲液：0.10M 磷酸钠+0.001M EDTA ，pH 7.27

温度：25℃

在这些参数下，摩尔吸收光系数为14.15±0.09*103LM-cm-[9].

1)标准曲线

用反应缓冲液配制10umDTT，20 umDTT，40 umDTT，80 umDTT，160 umDTT，

320 umDTT。用缓冲液配制10mM 的ELLMAN试剂。准备两个比色皿。

①加入100ul反应缓冲液到样品管和对照管中，在412nm测定吸收值，吸收值调

节到0.

②加入100ul反应缓冲液到对照管中，加入100ul ELLMAN试剂到样品管中，在

412nm测定吸收值A DTNB。

③加入100ul蛋白质溶液到对照管中，加入100ul蛋白质溶液到样品管中，混匀，

3~5min后测定吸收值，直到值不再增加，记为A final。

④A412nm=A final-（3.1/3.2）(A DTNB-A buffer),制作标准曲线。

2）样品巯基测定