冰冻切片

有关冰冻切片的应用及制作方法的改进
摘要：冰冻切片是借助低温冷冻将活体组织快速冻结达到一定的硬度进行制片的方法，我们通过探讨制片效果比较理想的冰冻切片制作方法，以提高冰冻切片的质量。

首先选取新鲜活体组织，取材后直接冻结，经恒温式冰冻切片机切片，冰冻固定液固定，HE染色。

剩余组织做石蜡切片对照。

结果，质量较好，染色鲜艳，镜下组织结构细胞形态清晰，细胞核浆对比分明。

因此，冰冻切片法简便快速，制片质量满意，可提高病理诊断的准确性。

关键词：冰冻切片；应用；制作；冰晶
冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。

因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而多应用于手术中的快速病理诊断。

冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，甲醇循环制冷冰冻切片法等。

这些方法，随着时代的变迁，科技的发展，许多年前被认为是非常重要的技术，现在也逐步被淘汰了。

当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切片法，正在受到青睐。

一、冰冻切片的应用
（1）在手术进行中，突然发现病人的病变与原诊断，原定手术方案不相符合，或者怀疑时，需要病理确定。

（2）了解淋巴结内是否有转移的肿瘤细胞，或者转移的程度，以利于确定是否需要彻底扫除淋巴结或者其它的治疗措施。

（3）对于已确定为恶性肿瘤的患者，则需要了解其手术范围是否足够，上下切缘是否有残存的肿瘤组织。

（4）在做剖腹探查时所发现的肿块或者异样的组织。

（5）显示组织中的脂肪和脂类物质，这常见于某些病例如脂肪瘤及肉瘤，某些科研组织等。

（6）某些酶的显示如ATP酶，琥珀酸脱氢酶等。

（7）神经病理学技术中的某些染色法如：Eager氏法，Marchi氏法，Cajal氏法，Hortega 氏法和Holzer氏法等。

（8）对某些物质所进行的免疫荧光的研究。

二、低温恒冷箱冷冻切片制作法
以Shandon As 620 E型恒温箱冷冻切片机为例，该机的箱面上有电子控制板，装有即时冷冻键和除霜键，启动即时冷冻键，机器马上进行工作状态，并可持续10mins。

启动即时除霜键，可将工作间顶部后面的制冷栅上的霜除掉，并可持续15mins。

有照明键一个，启动该键可照明工作间，有利工作及观察组织的冰冻状况。

配有消毒键一个，当进行一周的工作或者一天的工作后，启动该键，可对工作间进行消毒。

当每天工作完毕时，可启动密锁键，锁住工作间。

除此之外，箱面的左边有四个按键，两个为快速自动进退键，两个为微小进退键，还有一个手动旋钮，调节修组织块时的进退。

冷冻箱内左边的冷冻台，温度可达-60℃左右，冷冻箱的中间为一台切片机，工作间的温度在0-30℃间可任意调节，并在箱面上的荧屏显示出来。

操作方法及步骤：
(1)取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。

(2)取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。

小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。

(3)将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。

(4)调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。

（5）调好防卷板。

制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。

切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。

这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上。

（6）应视不同的组织选择不同的冷冻度。

冷冻箱中冷冻度的高低，主要根据不同的组织而定，不能一概而论。

如：切未经固定的脑组织，肝组织和淋巴结时，冷冻箱中的温度不能调太低，在-10- -15℃左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时，可调在-15～20℃左右，切带脂肪的组织时，应调至-25℃左右，切含大量的脂肪时，应调至-30℃。

(7)快速染色:冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定1分钟后即可染色。

以往，为了防止切片脱落，当切片附贴于载玻片后，即用电吹风吹干后再固定。

根据实验对比认为这种做法欠妥未经固定的切片，强热作用后，蛋白发生变性，核内含有的物质由于热的作用融合在一起，染色后镜下分辨不出核内的各种物质。

冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定，这样可以使切片中细胞内各种物质都在没有任何变化的情况下被固定起来，核染色质清晰，核仁明显，其他物质都完好保存。

方法：①切片固定30秒－1分钟；②水洗；③染苏木素3－5分钟；④分化；⑤于碱水中返蓝20秒；⑥伊红染色10－20秒；⑦脱水，透明，中性树胶封固。

三、冰冻切片制作方法有关改进
冰冻切片的方法是一种最省时最快速的制片方法，因此主要用于临床手术中的病理诊断。

手术中等待冰冻快速病理报告，以病变性质而决定手术方式和范围。

而及时、准确的发出报告需要高质量的冰冻切片，鉴于冰冻切片常出现染色模糊不清的现象，对病理判断造成困难，甚至造成误诊或漏诊，实践中我们对此做了一些改进。

其原理是：冷冻使组织变硬以代替石蜡做浸蜡。

将组织固定在标本托上短时间内冻好进行切片。

术中确诊病变性质，决定手术范围，因此做出高质量的冷冻切片至关重要。

这就要求每个病理技术人员不仅要有高度的责任心，还要有熟练的技术，在最短时间内制出高质量的切片。

我们在工作中，经过反复试验和不断改进，摸索出一种制片效果比较理想的冰冻切片制作法，在术中病理诊断取得满意的效果，现介绍如下：
1、材料与方法
（1）材料
冰冻切片，其中涉及到的组织有乳腺，卵巢，甲状腺。

采用德国莱卡恒温式冷冻切片机。

（2）方法
择取新鲜活体组织取材后直接冻结、切片、即投入固定液（配制方法：40%福尔马林15 mL，95%乙醇80 mL，冰乙酸5 mL）中，固定1 min～2 min，入苏木素染核1 min～2 min，水洗后，1%盐酸乙醇分化数秒，水洗后，0.1%氨水返蓝，水洗后，入1%水溶性伊红10 s左右，水洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封固。

2、结果
使用该方法所制冰冻切片速度明显提高，切片质量较好，染色鲜艳，镜下组织结构，细胞形态清晰，细胞核，细胞浆色彩鲜艳对比分明，术后诊断符合率达96%以上。

3、讨论
病理技术是病理学诊断不可分割的一部分，制片质量的好坏很大程度上影响病理医生做出正确的病理诊断。

因此，保证和提高制片质量是每个病理技术员的责任。

为了保证制片质量，减少差错，防范责任事故，避免医疗纠纷，有必要加强对病理技术进行科学规范管理和制片的控制。

在冰冻切片方面我们主要从以下环节上加强质控：
（1）组织取材大小
组织块大小适宜，理想取材大小为1.5 cm×1.5 cm，厚2 mm。

组织过大，切片时阻力过大，
易产生皱折，刀痕，组织易崩碎，增加制片难度，影响诊断。

如需在同一标本托上放大小两块组织时，应尽量冻成一个平面，与刀锋平齐，以防切片不完整，发生漏诊。

若送检组织过小，请预先速冻一冷台面，再行包埋，利于制片。

（2）冷冻时间
速冻时间过长，切片呈碎屑或条痕状，其处理方法是：切出完整平面后用戴乳胶手套的拇指按压回温，直到切片完整为止，反之，时间过短，切片呈粥糜状或切不下来，则需继续冷冻。

（3）切片
切片时用力均匀，厚度约4 μm～5 μm，特殊要求时可达3 μm，切好的组织在干净的玻片上粘附时可顺着一个方向稍微用力轻轻一带，可避免组织摊片过程中皱折，切好后立即放入提前配制好的冰冻切片固定液中及时固定1 min～2 min［１］。

（4）染色
切片后做快速HE染色,苏木素染色过程需加热进行,一般1 min～2 min即可。

这样做出来的快速切片镜下观结构完整、平坦、无皱折。

细胞核与细胞质染色色泽鲜艳,对比清晰,细胞无肿胀,无收缩,近似常规石蜡切片,封片时注意无气泡及无溢液,切片整洁,标签清楚端正,根据需要可切出半张玻璃片大小,厚薄均匀,一层细胞的组织切片［２］。

(5)冰晶的形成致使无法及时准确地为临床提供病理诊断依据。

我们知道，生物体是由细胞构成的，一般情况下，细胞中水分约占80%～90%，水在各种组织中含量最多，其解决方法为：①在不影响病理诊断的前提下，标本取材尽量小一些，组织厚度勿超过4 mm，这样有利于组织的快速冻结，将组织块快速移到冷冻头上骤冷以缩短冷冻时间,减少冰晶现象出现,有效防止冰晶挤压周围组织，改变甚至破坏组织原来的形态结构［３］。

②临床科室若术中需要冰冻，应通知病理科，以便提前开机做好准备，这样可避免由于缓慢冷冻所产生的冰晶。

因为冷却速度愈快，过冷温度越低，所形成的晶核数量越多，晶体来不及生长就被冻结，从而失去了形成较大冰晶的机会。

③需要术中进行快速病理诊断的活检组织，最好用一次性塑料或乳胶手套盛放，切忌用纱布包裹组织，以免纱布上的线毛粘在组织上，不利于制片，且易损伤刀刃。

④临床医师送检标本尽量避开水源不要用生理盐水浸泡或用湿纱布包裹组织，由于液体浸泡后，组织内水分会增加，易造成冷冻后组织内冰晶形成增多。

组织送检取材时，如遇含水量高的标本时，应尽量用干纱布吸干水分后再行冷冻，避免由于冰晶形成出现诊断上的失误。

对于冰冻切片的质量因素主要有以上几点，固然还存在某些其他方面的因素。

如果能正确对待以上几方面的问题，冰冻切片的质量方可得到保证，且能制备出一张质量优秀的切片，为明确病理诊断提供较为便利的客观条件。

参考文献
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