第18章酵母双杂交系统83页PPT
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Gal4的DNA-BD可识别位于Gal4效应基因的 UAS，并可与之结合；
Gal4的AD则可与转录复合物中其他成分结合， 激活UAS下游报告基因LacZ的转录。
酵母转录因子（Gal 4）
与BD-fusion ---诱饵（bait）
与AD-fusion ---猎物或靶蛋白（prey or target protein）
材料构建cDNA文库，能分析不同亚细胞部位和功 能的蛋白质，适用于部分细胞质、细胞核及膜结合 蛋白。
四、酵母双杂交系统的应用现状
➢ 分析已知蛋白之间的相互作用 ➢ 对蛋白质功能域的分析，如可将待测蛋白质进行点 突变或缺失突变再进行双杂交。 ➢ 用已知功能蛋白质筛选双杂交cDNA文库，研究蛋 白质之间相互作用的传递途径，发现新基因。 ➢ 分析新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因 去筛选文库，再根据筛的已知基因推测新基因功能。 ➢ 绘制蛋白质相互作用系统图谱 ➢ 在药物设计中的应用
报告基因（reporter gene）
---Lac Z（编码β-半乳糖苷酶）
（二）酵母双杂交系统的原理
X
DNA-BD
GAL4 UAS
Promoter
lacZ(or HIS) reporter gene
GAL4 UAS
Promoter
AD
Y
lacZ(or HIS) reporter gene
X
DNA-BD
三、酵母双杂交系统的优点
1. 高敏感性。 2. 原因：
3.
①采用高拷贝和强启动子的表达载体，使融
合蛋白过量表达；
4.
②激活结构域和结合结构域结合形成转录起
始复合物，之后又与启动子结合，此三元复合体
使融合蛋白各组分间结合更趋于稳定；
5.
③通过mRNA使信号放大；
6.
④检测的结果是基因表达产物的累积效应，
第一节 酵母双杂交系统简介
酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母 中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用， 对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能通过 报告基因的表达产物敏感地检测得到。
它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之 间关系的技术。
该技术既可用来研究哺乳动物基因组编码 的蛋白质之间的相互作用，也可用来研究高等 植物基因组编码的蛋白质之间的相互作用。
GAL4 UAS
AD
Y
Promoter
transcription
lacZ(or HIS) reporter gene
酵母双杂交动画演示 （英文）
报道株
经改造的、含报告基因的重组质粒的宿 主细胞。
酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有 许多优点:
❖ 易于转化、便于回收扩增质粒 ❖ 具有可直接进行选择的标记基因和特征性报告基因 ❖ 酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白相
可检测存在于蛋白质间的微弱或暂时的相互作用。
三、酵母双杂交系统的优点
1. 高敏感性。 2. 真实性。检测在活细胞内进行，作用条件与ห้องสมุดไป่ตู้用力
无需模拟，在一定程度上代表细胞内的真实情况。 3. 简洁性。融合蛋白相互作用后，减少了制备抗体和
纯化蛋白质的繁琐步骤。 4. 广泛性。采用不同组织器官细胞类型和分化时期的
两个结构域中的DNA-BD由位于N-末端的 1～147位多肽构成，能识别位于Gal4基因的上 游激活序列(upstream activation sequence， UAS)。
此外，在其N-端还具有一段核定位序列。 AD由位于C-末端的768～881位多肽构成。
当Gal4的两个结构域位于不同肽链上，只要 它们在空间上充分接近，则能恢复Gal4作为转 录因子的活性。
一、酵母双杂交系统的建立和基本原理 （一）酵母双杂交系统的建立
经典文献出处
❖ Fields S, Song O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature, 1989, 340(6230):245-246
1989年美国纽约州立大学的Fields和Song首先描述 了酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)。
该系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过 程的认识。真核生物基因转录需要反式转录激活因子的 参与，真核生长转录因子含有两个不同的结构域：
转录激活因子
DNA结合结构域(BD) (DNA binding domain)
互结合
改造后的酵母细胞的特点：
❖ 基因组中GAL4基因是缺失型的 ❖ 基因组中引入额外的报告基因LEU、TRP、
HIS
通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落
二、酵母双杂交系统的基本策略
➢ 表达“诱饵”和“猎物”蛋白； ➢ 检验这两种蛋白表达后能否激活酵母中的报 告基因。
做法：首先构建能表达“诱饵”和“猎物” 蛋白的表达载体。该载体中可加入进行营养型 筛选的基因。
Fields和Song将两个融合蛋白分别构建在穿梭 质粒上，一个是将Gal4的DNA-BD与酵母蛋白 SNF1融合；另一个是将Gal4的AD和酵母蛋白 SNF4融合。
其中，SNF1是一种丝氨酸/苏氨酸的蛋白激 酶，SNF4是它的一个结合蛋白，这两种蛋白是 已知可以相互作用的。
当两种穿梭质粒共转化含有Gal4结合位点的报 告基因LacZ的酵母菌株后，通过SNFl与SNF4的 相互作用，Gal4的DNA-BD与Gal4的AD靠近, 形 成一个大的复合物Gal4BD-SNF1-SNF4-Gal4-AD。
蛋白质之间相互作用研究的重要性
蛋白质之间相互作用以及通过相互作用 而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的 主要完成者。
几乎所有的重要生命活动，包括DNA的 复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转 导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互 作用。
研究蛋白质相互作用的常用方法
•酵母双杂交（yeast two hybridization） •亲和层析 •免疫共沉淀 •蛋白质交联 •基于GFP的细胞内蛋白质相互作用的研究方法 •噬菌体显示系统筛选
转录激活结构域(AD) (activation domain)
这两个结构域各具功能，互不影响, 单独存在时没有转录激活的功能，只有两 者通过共价或非共价键连接建立起来的空 间结构方可表现出一个完整的激活特定基 因表达的激活因子的功能。
Gal4为酵母半乳糖苷酶基因gal1的转录激活 因子，天然的Gal4分子是由一条由881个氨基 酸残基组成的多肽链。
Gal4的AD则可与转录复合物中其他成分结合， 激活UAS下游报告基因LacZ的转录。
酵母转录因子（Gal 4）
与BD-fusion ---诱饵（bait）
与AD-fusion ---猎物或靶蛋白（prey or target protein）
材料构建cDNA文库，能分析不同亚细胞部位和功 能的蛋白质，适用于部分细胞质、细胞核及膜结合 蛋白。
四、酵母双杂交系统的应用现状
➢ 分析已知蛋白之间的相互作用 ➢ 对蛋白质功能域的分析，如可将待测蛋白质进行点 突变或缺失突变再进行双杂交。 ➢ 用已知功能蛋白质筛选双杂交cDNA文库，研究蛋 白质之间相互作用的传递途径，发现新基因。 ➢ 分析新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因 去筛选文库，再根据筛的已知基因推测新基因功能。 ➢ 绘制蛋白质相互作用系统图谱 ➢ 在药物设计中的应用
报告基因（reporter gene）
---Lac Z（编码β-半乳糖苷酶）
（二）酵母双杂交系统的原理
X
DNA-BD
GAL4 UAS
Promoter
lacZ(or HIS) reporter gene
GAL4 UAS
Promoter
AD
Y
lacZ(or HIS) reporter gene
X
DNA-BD
三、酵母双杂交系统的优点
1. 高敏感性。 2. 原因：
3.
①采用高拷贝和强启动子的表达载体，使融
合蛋白过量表达；
4.
②激活结构域和结合结构域结合形成转录起
始复合物，之后又与启动子结合，此三元复合体
使融合蛋白各组分间结合更趋于稳定；
5.
③通过mRNA使信号放大；
6.
④检测的结果是基因表达产物的累积效应，
第一节 酵母双杂交系统简介
酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母 中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用， 对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能通过 报告基因的表达产物敏感地检测得到。
它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之 间关系的技术。
该技术既可用来研究哺乳动物基因组编码 的蛋白质之间的相互作用，也可用来研究高等 植物基因组编码的蛋白质之间的相互作用。
GAL4 UAS
AD
Y
Promoter
transcription
lacZ(or HIS) reporter gene
酵母双杂交动画演示 （英文）
报道株
经改造的、含报告基因的重组质粒的宿 主细胞。
酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有 许多优点:
❖ 易于转化、便于回收扩增质粒 ❖ 具有可直接进行选择的标记基因和特征性报告基因 ❖ 酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白相
可检测存在于蛋白质间的微弱或暂时的相互作用。
三、酵母双杂交系统的优点
1. 高敏感性。 2. 真实性。检测在活细胞内进行，作用条件与ห้องสมุดไป่ตู้用力
无需模拟，在一定程度上代表细胞内的真实情况。 3. 简洁性。融合蛋白相互作用后，减少了制备抗体和
纯化蛋白质的繁琐步骤。 4. 广泛性。采用不同组织器官细胞类型和分化时期的
两个结构域中的DNA-BD由位于N-末端的 1～147位多肽构成，能识别位于Gal4基因的上 游激活序列(upstream activation sequence， UAS)。
此外，在其N-端还具有一段核定位序列。 AD由位于C-末端的768～881位多肽构成。
当Gal4的两个结构域位于不同肽链上，只要 它们在空间上充分接近，则能恢复Gal4作为转 录因子的活性。
一、酵母双杂交系统的建立和基本原理 （一）酵母双杂交系统的建立
经典文献出处
❖ Fields S, Song O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature, 1989, 340(6230):245-246
1989年美国纽约州立大学的Fields和Song首先描述 了酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)。
该系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过 程的认识。真核生物基因转录需要反式转录激活因子的 参与，真核生长转录因子含有两个不同的结构域：
转录激活因子
DNA结合结构域(BD) (DNA binding domain)
互结合
改造后的酵母细胞的特点：
❖ 基因组中GAL4基因是缺失型的 ❖ 基因组中引入额外的报告基因LEU、TRP、
HIS
通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落
二、酵母双杂交系统的基本策略
➢ 表达“诱饵”和“猎物”蛋白； ➢ 检验这两种蛋白表达后能否激活酵母中的报 告基因。
做法：首先构建能表达“诱饵”和“猎物” 蛋白的表达载体。该载体中可加入进行营养型 筛选的基因。
Fields和Song将两个融合蛋白分别构建在穿梭 质粒上，一个是将Gal4的DNA-BD与酵母蛋白 SNF1融合；另一个是将Gal4的AD和酵母蛋白 SNF4融合。
其中，SNF1是一种丝氨酸/苏氨酸的蛋白激 酶，SNF4是它的一个结合蛋白，这两种蛋白是 已知可以相互作用的。
当两种穿梭质粒共转化含有Gal4结合位点的报 告基因LacZ的酵母菌株后，通过SNFl与SNF4的 相互作用，Gal4的DNA-BD与Gal4的AD靠近, 形 成一个大的复合物Gal4BD-SNF1-SNF4-Gal4-AD。
蛋白质之间相互作用研究的重要性
蛋白质之间相互作用以及通过相互作用 而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的 主要完成者。
几乎所有的重要生命活动，包括DNA的 复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转 导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互 作用。
研究蛋白质相互作用的常用方法
•酵母双杂交（yeast two hybridization） •亲和层析 •免疫共沉淀 •蛋白质交联 •基于GFP的细胞内蛋白质相互作用的研究方法 •噬菌体显示系统筛选
转录激活结构域(AD) (activation domain)
这两个结构域各具功能，互不影响, 单独存在时没有转录激活的功能，只有两 者通过共价或非共价键连接建立起来的空 间结构方可表现出一个完整的激活特定基 因表达的激活因子的功能。
Gal4为酵母半乳糖苷酶基因gal1的转录激活 因子，天然的Gal4分子是由一条由881个氨基 酸残基组成的多肽链。