ATR_FTIR检测毕赤酵母发酵中甘油和甲醇浓度_吴胜

FTIＲ 结合 PLS 建立甘油和甲醇的预测模型， 模型具有良好的稳定性和预测性， 甘油预测模型的 SEC 和 SEV 分 别为 0. 171 和 0. 532 g / L， 甲醇预测模型的 SEC 和 SEV 分别为 0. 129 和 0. 248 g / L。在 5 L 发酵罐中运用建立的 模型预测发酵液中甘油和甲醇的浓度， 预测标准误差（ SEP） 分别为 1. 09 和 0. 86 g / L， 表明模型稳定， 能有效指导 stat） 调控甲醇浓度下的比生长速率（ μ ） 和比生产 实际生产。比较 5 L 发酵罐中分别采用 FTIＲ 调控和溶氧（ DOFTIＲ 调控下比生长速率和比生产速率均高于溶氧（ DOstat） 调控。 速率（ Q p ） ， 结果表明， 关键词 ATＲFTIＲ， 毕赤酵母甘油， 甲醇， 比生长速率， 比生产速率
图4 Fig. 4
甘油和甲醇的红外特征吸收峰
Absorption peak of IＲ spectrum of glycerol and methanol
甘油初始浓度较大， 采用培养开始时无甘油的培 养基作 为 背 景， 选 取 甘 油 红 外 谱 图 中 1 140 ～ 950 cm － 1 的波数范围， 在 0. 5 ～ 50 g / L 配置了 28 个不同 浓度水平的甘油培养基溶液， 其中 17 个作为建模 11 个作为验证集； 由于甲醇初始浓度较小， 集， 诱导 时间较长， 为了校正背景变化对对谱图的干扰， 采集 诱导开始时和结束后继续培养直至 DO 回升至满度 视此时甲醇浓度为零， 分别为 B1 和 时的 2 个背景， B2 ， 以 B = （ B1 + B2 ） /2 作为背景， 选取 1 075 － 930 cm 的波数范围， 在 0. 1 ～ 30 g / L 配置 26 个不同浓 度水平的甲醇培养基溶液， 其中 14 个作为建模集， 12 个作为验证集。 以 2 cm － 1 为输入值点， 构成输入 变量， 输入到 UnscrambLer10. 2 中。 光谱 的 预 处 理， 通常有平滑、 均值化、 基线校正， 多元散射校正， 导数 等。本研究中分别以原始光谱、 基线校正及一阶导数 分别建立 PLS 模型， 结果如表 1 所 进行光谱预处理，
－1 物质的结构信息， 特别是在 1 800 ～ 800 cm ， 这一波 －1
1
1. 1
材料和方法
材料 菌株
+ 表达 重 组 人 溶 菌 酶 的 Mut 型 的 毕 赤 酵 母
1. 1. 1
SMD1168 ， 由本实验室提供。 1. 1. 2 培养基 种子培养基（ L） ： 蛋白胨 20 g，酵母粉 10 g，葡 萄糖 10 g。 5 L 罐培养基（ L） ： 甘油 40 g， 85% 磷酸 6. 7 mL， CaSO4 0. 93 g， K2 SO4 18. 2 g，MgSO4 ·7H2 O 14. 9 g， KOH 4. 13 g， PTM1 4. 5 mL。 甘油补料培养基： 50% （ W / V） 甘油（ 含 12 mL / L PTM1 ） 。 甲醇补料培养基： 含有 12 mL / L PTM1 的甲醇。 1. 2 1. 2. 1 实验方法 种子培养
图1 Fig. 1
毕赤酵母批培养中甘油 、 甲醇和产物变化 Product，glycerol and methanol concentrations
versus time during the course of a fed batch process
2. 2
PLS 定量模型的建立
培养采用无机盐培养基， 成分明确， 生长阶段甘 ， 。 油作为碳源 诱导阶段以甲醇为碳源 为了对发酵液 红外光谱有定性认识以及确定菌体 、 培养基中无机盐 成分是否对红外光谱图有影响， 分别采集不含碳源的 培养基溶液（ Med） 和甘油批培养阶段、 甲醇诱导阶段 发酵液的红外光谱图。
PLS 模型建立由 Unscram软件 OMNIC5. 1 进行处理， bler 10. 2 软件完成。
图2 Fig. 2
培养开始和过程中的发酵液光谱图
Spectra of （ A） fermentation medium at the beginning and in the process with glycerol （ B） fermentation medium at the beginning and in the process with methanol
段称为指纹图谱区， 对应分子和官能团的指纹振动， 既能对已知物定量分析， 也能鉴定可能存在的未知 物
［10 ］
。 通 过 使 用 衰 减 全 反 射 （ Attenuated Total Ｒe-
flection，ATＲ） 技术， 有效地解决了在发酵液中强烈 ［11 － 14 ］ 。 生物 的水吸收和 MIＲ 穿透能力较弱的问题 过程中所包含的物质是十分复杂的 ， 采集的红外光谱 通常包含了诸多信息， 选取合适的化学计量学方法能 建立预测模 够在复 杂 的 光 谱 图 中 提 取 有 效 信 息， 型
说明此处代表碳源对光谱的影响。 培养基中无机离 子增减变化可以用渗透压强度来表示 ， 测定培养过程 中发酵液的渗透压， 图 3 中在培养初期渗透压有一个 小幅的下降， 从开始时的 1 355 mOsm / L 下降到 1 210 mOsm / L 后基本维持恒定， 说明培养过程中无机离子 强度没有发生较大的变化， 从另一个角度说明无机盐 对红外谱图的影响可以忽略不计。 所以后续光谱采 集中均采用无甘油和甲醇的培养基 （ Med） 作为背景。 1 800 ～ 800 cm － 1 波数内的红外光谱吸收对于组 分定量有十分重要的意义。以 Med 为背景， 采集 20 、 10 、 5、 1 g / L 的甘油红外吸收谱图， 如图 4A 所示， 在 1 115. 8 ～ 994 cm － 1 区间处有甘油的 C —O 键对称与 1 046 ， 992 反对称的伸缩振动吸收峰， 分别在 1 098 ， cm － 1 处有 3 个明显的峰， 且随浓度升高峰面积增加，
第一作者： 硕士研究生（ 杭海峰、 张嗣良教授为通讯作者） 。 * 国 家 973 计 划 （ 2013CB733600 ） ； 国 家 科 技 支 撑 计 划 （ 2011BAF02B02） ； 中央高校基本科研业务费资助 （ WF1114019） 收稿日期： 2013 － 11 － 26 ， 改回日期： 2013 － 12 － 16
［15 － 16 ］
。傅里叶红外光谱法 （ Fourier Transform In-
frared Spectroscopy，FIIＲ） 的快速、 通用、 稳定、 无破坏 ， 性和化学计量学方法的发展 使得红外光谱法结合衰 减全反射 技 术 已 经 在 生 物 过 程 监 测 中 有 了 诸 多 应
［4 ］
FTIＲ 结 合 偏 最 小 二 乘 法 本研 究 中， 应 用 ATＲ（ Partial Least Squares，PLS） 建立了甘油、 甲醇浓度的 预测模型， 该方法快速、 无破坏性、 样品无需处理。模 型成功在 5 L 发酵罐中监测甘油和甲醇的浓度变化 ， 并通过分析比生长速率和比生产速率 ， 比较了两种甲 醇浓度调控的方法。
10 、 5、 1 g / L 的 甲 醇 红 外 吸 收 谱， 图 4B 中 甲 醇 在 －1 1 018 cm 处有一单峰， 且峰形较好， 吸光度与甲醇 浓度呈现出一定线性关系。
图3 Fig. 3
培养过程中的渗透压
Alteration of osmotic pressure during the process
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2014 Vol. 40 No. 3 （ Total 315 ）
研究报告
－1 图 2 中的光谱图基本重合， 在1 150 ～ 1 000 cm 波数内出现变化， 鉴于两者的差别只有碳源的不同， －1 而在 1 480 ～ 1 130 cm 区间虽然光谱有不同， 但是 并没有与浓度成一定关系。 以 Med 为背景， 采 20 、
DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2014.03.010
研究报告
ATＲFTIＲ 检测毕赤酵母发酵中甘油和甲醇浓度 *
吴胜， 杭海峰， 郭美锦， 储炬， 庄英萍， 张嗣良
（ 华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室， 200237 ） 上海， 摘 要 采用无机盐培养基毕赤酵母发酵生产重组人溶菌酶， 以人工配置的标准溶液作为建模集， 利用 ATＲ-
甲醇营养型毕赤酵母已经成为生产外源蛋白最 常用的生产菌种之一， 培养基的改进及发酵条件的优 化显著提高了工业化生产通量
［1 － 3 ］
用
［17 － 21 ］
。
。 毕赤酵母发酵
主要采用无机盐培养基， 在甘油批培养阶段， 以甘油 ， 为碳源菌体快速生长 获得合适的菌体密度之后， 需 要监测甘油是否全部耗尽
30 ℃ ， 220 平板上挑取单菌落到种子培养基中， r / min， 培养 20 ～ 25 h。 1. 2. 2 5 L 罐发酵 本实验采用 5 L 搅拌式反应器（ 上海国强生化工 工作体积为 3 L， 程装备有限公司） 进行批培养发酵，
2014 年第 40 卷第 3 期（ 总第 315 期）
1
－1 2 cm － 1 ， 扫描次数 64 次， 波数范围 4 000 ～ 400 cm ， 每 1 个样品扫描 3 次。 采集的光谱由自带光谱处理
2
2. 1
结果和分析
毕赤酵母发酵表达溶菌酶概述 图 1 为本研究中一批毕赤酵母发酵甘油 、 甲醇浓
度变化图。分为 3 个阶段： 第 1 阶段为甘油批培养阶 段， 经过一段时间的迟滞期后进入对数期， 甘油开始 快速消耗， 菌体量快速增加， 第 24 h 左右初始甘油耗 尽。第 2 阶 段 为 甘 油 补 料 批 培 养 阶 段， 维 持 DO ＞ 30% ， 限制性补加甘油， 获得合适的菌体浓度后， 停止 甘油流加。经过 1 ～ 2 h 的饥饿， 甘油全部耗尽之后， 进入甲醇诱导外源蛋白表达阶段， 这一阶段维持 DO 大于 20% 。诱导前 48 h 溶菌酶酶活稳定增长， 诱导 72 h 之后比生产 进入到 48 h 之后酶活有一个跃升， 速率下降， 到培养结束时酶活为 47 200 u / mL。
食品与发酵工业
FOOD AND FEＲMENTATION INDUSTＲIES
源自文库
1 vvm 和 起始搅拌、 通气量和温度分别为 300 r / min、 30 ℃ ， 发 酵 过 程 中 用 28% 氨 水 控 制 发 酵 液 pH 至 5. 5 ， 接种量为 10% ， 培养过程中调节搅拌转速和通 气量控制溶氧。 1. 2. 3 分析方法 菌体浓度及细胞干重： 菌液稀释后于波 长 600 nm 处以去离子水为对照进行比色测定， OD600 = OD 10 000 r / min 离心 读数 × 稀释倍数。10 mL 发酵液， 10 min， 80 ℃ 烘干至恒重， 去上清液， 水洗 2 次， 光密 度值与细胞干重呈线性。 Y = 0. 569 X + 0. 492 OD600 值； Y， 式中： X ， 细胞干重（ DCW） 。 甘油含量： 通过甘油试剂盒 （ 北京普利莱基因技 术有限公司） 测定。 甲醇含量： 通过 GC － 1120 气相色谱仪 （ 上海舜 宇恒平仪器有限公司 ） 测定。 检测条件： N2 流量为 15 mL / min，H2 和空气的流量分别为 30 mL / min 和 300 mL / min， 毛细管色谱柱温度为 180 ℃ ， 气化室氢 火焰温度为 100 ℃ ， 氢火焰温度为 180 ℃ ， 进样量为 1 μL。 450 溶菌酶活性测定： 制备溶壁微球菌悬浮液， nm 波长下吸光值在 0. 7 ～ 0. 8 。 取 100 μL 发酵液的 上清液迅速加入微球菌悬浮液中反应 1 min， 观察读 数值的下降并计算斜率： 酶活 = 斜率 × 稀释倍数 × 60 × 10 000 FTIＲ： 红外光谱图由带有 ATＲ 附件的 NicoLet － 6700 型傅里叶红外光谱仪 （ 美国赛默飞世尔科技有 限公司） 采集， 维持恒定的环境温度和湿度， 分辨率
， 发酵液中残余的甘油
［5 ］
将会影响外源蛋白的启动表达效率 是诱导剂
［6 ］
。 进入诱导阶
段后碳源转换为甲醇， 此时甲醇既充当唯一的碳源又 ， 培养过程中甲醇不会被完全利用而累 积， 为了防止甲醇在发酵液中的过量累积抑制细胞生 ［7 － 9 ］ 。 动态监测发酵液中的甲醇浓度成为必要 长， 红外光谱（ 4 000 ～ 400 cm ） 能够提供几乎所有