分子荧光分析法(郭伟)

萘的激发光谱、荧光和磷光光谱
注：相当于荧光物质的吸收光谱。 激发荧光最灵敏波长（λex）是荧光强度最大所对应波长。
荧光光谱（ 荧光光谱（fluorecence spectrum）：固定激发光 ）：固定激发光 ）： 波长为最大激发波长， 波长为最大激发波长，测 定不同荧光波长下的荧光 强度，以发射波长为横坐 强度， 标，荧光强度为纵坐标作 得到荧光发射光谱。 图，得到荧光发射光谱。
1、光源 理想的光源能发射含有各种波长的紫外和可见 且光强度较大。 光，且光强度较大。 荧光光度计中，常使用高压汞灯和卤钨灯 高压汞灯和卤钨灯作光源 荧光光度计中，常使用高压汞灯和卤钨灯作光源 荧光分光光度计中常用高压氙灯 高压氙灯作光源 荧光分光光度计中常用高压氙灯作光源 2、单色器 荧光光度计用滤光片作单色器， 荧光光度计用滤光片作单色器，不能进行荧光光谱 和激发光谱的扫描； 和激发光谱的扫描； 大多数荧光分光光度计一般采用两个光栅单色器， 大多数荧光分光光度计一般采用两个光栅单色器， 有较高的分辨率，能扫描图谱。 有较高的分辨率，能扫描图谱。
( −2.3abc ) ( −2.3abc )2 ( −2.3abc )3 F = kϕI 0 [ 1 − ( 1 + + + + L )] 1! 2! 3!
当 ≤ 0.05时 F = 2.3kϕI0abc = K' C abc ，
F = K' C
(荧光定量分析法的依据) 荧光定量分析法的依据)
结论：对某一物质的稀溶液（A=abc<0.05），在 一定条件下，当激发光波长、强度和液层厚度固 定时，物质发出的荧光强度与该溶液的浓度呈正 比。
光致发光包括荧光和 光致发光包括荧光和磷光 荧光 荧光包括分子荧光和 荧光包括分子荧光和原子荧光 分子荧光 分子荧光分析法：根据物质的分子吸收光能后发射 出的荧光光谱的特征和强度，对物质进行定性和定 量的分析方法。 优点：灵敏度高，比紫外可见光谱法高2-4个数量 灵敏度高，比紫外可见光谱法高2 灵敏度高 选择性好。 级； 选择性好。 缺点：应用范围小。
0
I F
I = I 0 ⋅10
− abc
I 0 − I = I 0 − I 010 − abc = I 0 ( 1 − 10 −abc )
溶液的荧光强度F与溶液吸收光的强度及荧光效 溶液的荧光强度F 率成正比 F = kϕI 0 ( 1 − 10 − abc ) = kϕI 0 ( 1 − e −2.3 abc )
传递途径 辐射跃迁 无辐射跃迁
荧光
磷光
系间跨越
内转换
外转换
振动弛豫
非辐射能量传递过程 振动弛豫(vibrational relexation)：各振动能级的分子 通过与溶剂分子的碰撞而将部分振动能量传递给溶 剂分子，其电子返回到同一电子能级的最低振动能 级间的过程；发生振动弛豫的时间10 -12s。 内部转换(internal conversion)：当两个电子激发态 之间的能量相差较小以致其振动能级有重叠时，受 激分子常由高电子能级以无辐射方式转移至低电子 能级的过程。
最大荧光波长（λem） ：光 谱上荧光强度最大的波长。
萘的激发光谱、荧光和磷光光谱
荧光物质的最大激发波长（λex）和最大发射波长（λem） 荧光物质的最大激发波长（ ）和最大发射波长（ ） 是鉴定物质的根据；也是定量测定最为灵敏的条件。 是鉴定物质的根据；也是定量测定最为灵敏的条件。
荧光光谱的特征 1、荧光光谱与激发光波长无关 电子跃迁到不同激发态能级， 电子跃迁到不同激发态能级，但均回到第一激发 单重态的最低振动能级再跃迁回到基态， 单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，从而荧光 发射光谱只有一个发射带，而且荧光光谱的形状与 发射光谱只有一个发射带， 激发波长无关。 激发波长无关。 2、荧光波长比激发波长较长: 荧光波长比激发波长较长: 荧光发射能量以激发能量低， 荧光发射能量以激发能量低，故荧光发射波长总 是大于激发光谱波长，这种现象又称红移。 是大于激发光谱波长，这种现象又称红移。 光谱图中，激发光谱总是在左 发射光谱总是在右 光谱图中，激发光谱总是在左，发射光谱总是在右。 总是在 总是在
荧光猝灭法（fluorescence quenching method）： 荧光物质加入某些猝灭剂后，其荧光强度 的减少与荧光猝灭剂的浓度呈线性关系，可用 于测定猝灭剂的含量。 比直接荧光法更灵敏、更有选择性。
（五）散射光 1.瑞利散射 光子与物质分子发生弹性碰撞，不发生 能量交换，运动方向改变；λ瑞利光＝λ入射光 2.拉曼散射 光子与物质分子发生非弹性碰撞，发生 能量交换，运动方向改变；λ拉曼光≠λ入射光 3.丁铎尔散射 散射光对荧光测定有干扰， 散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入射光 拉曼光， 更长的拉曼光 因其波长与荧光波长接近， 更长的拉曼光，因其波长与荧光波长接近，对荧光 测定干扰更大，必须消除。 测定干扰更大，必须消除。
第三节 荧光分析仪器
荧光分光光度计的主要部件：光源、激发单色器、 荧光分光光度计的主要部件：光源、激发单色器、 发射单色器、样品池、检测系统、显示系统。 发射单色器、样品池、检测系统、显示系统。
激发单色器 光源 发 射 单 色 器 示器· 示器 器 栩器 检测器 样品池
与分光光度计 有两点不同： 有两点不同： ①两个单色器 ②检测器与激发光 成直角
第一节 概述
物质分子吸收了一定能量后 其电子由基态跃迁至激发态, 物质分子吸收了一定能量后,其电子由基态跃迁至激发态, 一定能量 当激发态分子以辐射形式将其能量释放返回基态时, 当激发态分子以辐射形式将其能量释放返回基态时,便产生分 子发光。根据这种现象建立的分析方法称为发光分析法 发光分析法。 子发光。根据这种现象建立的分析方法称为发光分析法。 根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下 几类： 几类： 光致发光： 光源来激发而发光 光致发光：以光源来激发而发光 发射 电致发光： 电能来激发而发光 电致发光：以电能来激发而发光 生物发光： 生物体释放的能量激发而发光 生物发光：以生物体释放的能量激发而发光 化学发光： 化学反应能激发而发光 化学发光：以化学反应能激发而发光
第二节
基本原理
一、分子荧光的发生过程 基态分子中，电子按能量最低原理成对地排列于一定的轨 道中分子内同一轨道中两个电子必须有相反的自旋方向，即自 旋量子数分别为1/2和-1/2. 总自旋量子数： S =
∑ Si
分子的多重性：M=2S+1 M=2S+1
S=0，M=1
S=1，M=3
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态 时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式 失去能量，称为去激发过程。
（二）温度的影响 温度增加，荧光效率和荧光强度下降。 （三）酸度的影响 pH影响荧光物质的存在形式 影响荧光物质的存在形式
无荧光 蓝色荧光 OHH+ 无荧光 OHH+
NH3+
pH < 2
NH2
7 < pH < 12
NHpH >13
pH影响荧光配合物的组成 pH影响荧光配合物的组成 Ga3++邻－二羟基偶氮苯 1:1配合物 产生荧光) 1:1配合物(产生荧光) 配合物( pH 6~7 3++邻－二羟基偶氮苯 Ga 1:2配合物 不产生荧光) 配合物( 1:2配合物(不产生荧光)
荧光： 第一激发单重态的最低振动能级→基态 荧光：10-7～10 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级 基态； 第一激发单重态的最低振动能级 基态； 磷光： 基态； 磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级 基态； ；第一激发三重态的最低振动能级→基态
二、激发光谱和荧光光谱 激发光谱（ 激发光谱（excitation spectrum）：固定荧光波 ） 改变激发光波长， 长，改变激发光波长，测 定不同波长光照射下荧光 强度的变化， 强度的变化，以激发波长 为横坐标， 为横坐标，荧光强度为纵 坐标， 坐标，可得荧光物质的激 发光谱。 发光谱。
λex
205nm
286nm 321nm 0.29
356nm 404nm 0.36
λ em 278nm ϕ 0.11
通常， 通常，具有π—π*跃迁结构的分子最容易产生荧光 而且共轭度越大，荧光效率越大，荧光波长长移。 而且共轭度越大，荧光效率越大，荧光波长长移。
2. 分子的刚性
分子刚性越强，分子振动越少，与其它分子碰撞 失活的机率下降，荧光效率提高。
OO C COOO
OC COO O
荧光素
Φ= 0.92，0.1M NaOH
酚酞
非荧光物质
3. 取代基对分子荧光的影响 ①给电子基团如-NH2、-OH、-OCH3、-CN等，使荧光增强。
②吸电子基团如-COOH、-NO2、-C=O、-F、-Cl等会减弱甚 至破坏荧光。
四、荧光强度与溶液浓度的关系 I
辐射能量传递过程 荧光发射：激发分子从第一激发单重态的最低振 动能级跃迁到基态各振动能级时所产生的光子辐 射称为荧光；荧光辐射能要比激发能量低，荧光 波长大于激发波长；荧光是相同多重态间的允许 跃迁，产生速度快，荧光发射时间为10-9-10-7s。 磷光发射：激发分子由第一激发三重态的最低振动 能级跃迁到基态各振动能级时所产生的光子辐射称 为磷光；磷光辐射能要比荧光辐射能量低，磷光波 长大于荧光波长；磷光发射时间为10-4-10s。
第十四章 分子荧光分析法
主讲：郭 伟 监督电话：3029128
光谱法： 光谱法：
按电磁辐射的能级跃迁方向分 ： 吸收光谱法（从基态跃迁到激发态） 吸收光谱法（从基态跃迁到激发态） 发射光谱法（激发态跃迁回基态） 发射光谱法（激发态跃迁回基态） 按电磁辐射的作用对象分 ： 原子光谱 分子光谱
紫外及可见分光光度法： 紫外及可见分光光度法：分子吸收光谱法 分子荧光分析法： 分子荧光分析法：分子发射光谱法 发光分析法
五、影响荧光强度的外部因素 （一）溶剂的影响 1、荧光强度在一定范围内可随溶剂粘度的减小而 减小。 减小。 溶剂和荧光物质反应， 2、溶剂和荧光物质反应，会使荧光峰的波长和荧 光强度改变。 光强度改变。 随着溶剂的极性的增加，荧光物质的π→π* π→π*跃 3、随着溶剂的极性的增加，荧光物质的π→π*跃 迁几率增加，荧光强度将增强， 迁几率增加，荧光强度将增强，荧光波长也发生红 移。 溶剂纯度。溶剂中有杂质会影响荧光光谱。 4、溶剂纯度。溶剂中有杂质会影响荧光光谱。
∗ 1
S
蒽的能级跃迁 b4 b3 b2 b1 b0 c0 c1 c2 c3 c4
∆E4 ∆E3 ∆E2 ∆E1
V=4 V=3 V=2 V=1 V=0
S0
三、荧光与物质的分子结构 荧光物质应具备的条件： 荧光物质应具备的条件： 分子具有强的吸收紫外可见辐射的结构（内因） 1、分子具有强的吸收紫外可见辐射的结构（内因） 2、具有较高的荧光效率 （一）荧光发射的量子产率
kF 发射的荧光量子数 ϕ= = k F + ∑ ki 吸收的光量子数 K F 荧光发射的速率常数， ∑ ki 无辐射跃迁的速率常数 之和； 荧光发射的速率常数， 之和；
荧光效率与物质的分子结构和所处的化学环境 条件有关。 条件有关。
（二）分子结构与荧光 荧光物质的分子结构应具备如下特征： 荧光物质的分子结构应具备如下特征： 1. 共轭结构（芳香族烃）
3、激发光谱与荧光光谱呈现镜像对称关系
100 80 60 F 40 20 0 200 V=4 V=3 V=2 V=1 V=0
a
b1 c c1 0 b0 b2 c2 b4
280
蒽的激发光谱（虚线） 蒽的激发光谱（虚线） 荧光光谱（实线） 荧光光谱（实线）
b3
360 440
c3 c4
520 nm
∆E4 ∆E3 ∆E2 ∆E1
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外部能量转换(external conversion)：激发分子与 溶剂或其他溶质分子之间相互碰撞失去能量，并 以热能的形式释放能量的过程。外转换使荧光或 磷光减弱或“猝灭”。 体系间跨越(intersystem crossing)：处于激发态分 子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变 化的过程；分子由激发单重态通过体系间跨越到 激发三重态。条件：激发态的振动能级有重叠时 宜发生。
pH 3~4
（四）荧光猝灭
荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引 起荧光强度降低或荧光强度不与浓度成线性关系的现象称 为荧光猝灭。 能引起荧光猝灭的物质叫荧光熄灭剂 能引起荧光猝灭的物质叫荧光熄灭剂
导致荧光熄灭的原因：
碰撞猝灭 静态猝灭 转入三重态的猝灭 荧光物质的自猝灭 内滤作用 激发光或发射光 M+热 M+hv→M*,M*+Q → M+热 M+Q → MQ 非荧光物质 引入碘、溴后， 引入碘、溴后，易发生体系间跨越 荧光物质浓度较高 溶液中有其它物质吸收荧光物质的