2007年禽流感核酸检测考核结果汇报

9
N1 Ct 值 19.24 22.46 27.46
30.59 33.15
考核标本的制备 1.稳定性检测： ➢ 冰盒内室温4天。 ➢ 冰盒内室温4天，后-20度2周。 2.可重复性验证： ➢ 不同仪器 ➢ 不同操作人 ➢ 不同标本抽样
10
运输和结果提交情况
本次考核标本在运输过程中均未出现问题， 接受标本时均有干冰存在并无液体漏出。
N
n
％
30
30
100
30
30
100
30
30
100
30
29
96.7
30
30
100
30
30
100
30
30
100
30
30
100
30
30
100
30
29
100
存在个别的问题
从这次问卷调查的结果看，各个省级CDC网络实验室的总体水平良好， 但是仍有一些问题存在。
PCR仪器设备不全
1
检测方法应用内容少
2
实验室分区不明确
4
07年考核目的
深入了解各省份禽流感核酸检测能力的基本 情况。 了解各省禽流感核酸检测工作中可能存在的 实际问题。 了解核酸检测工作的不足并确定下一步的工 作重点。
5
组织形式
本次考核由中国CDC发文，国家流感中心执行。 本次考核定位为基础水平考核，并附有情况调 查表。 本次考核标本发放全国31个省（自治区、直辖 市）的流感网络实验室，考核时间为1个月。 本次考核内容为鉴定10份盲样的型别及亚型。
本次考核标本发放全国31个省（自治区、直 辖市），到截止日期为止除西藏外所有被考核 实验室均提交了结果。
11
国家流感中心
考核结果
22个省份结果正确，
河北、辽宁、黑龙江、云南、贵州五省 H3N2+B标本由于实验思路不同未检出B型， 黑龙江未检测出H3,用AN2引物检测出N2亚 型。陕西没有检出H9只检出了N2。
sample NC
N1 PC RNP
44
sample NC PC RNP
Interpretation of Real-time RT-PCR Results
Test reactions
A
sample + sample sample sample -
H1 H3 H5 - -+ - -+ -----
B RNP Results - + A/H5 - + Inconcl - + Neg - - Inconcl
14
国家流感中心
考核结果分析
15
国家流感中心
考核结果分析
Realtime结果应该有两个图，一个应包含阳 性曲线和域值线的情况并标明所用引物和样 品名称，另一个应包含机器显示的CT值。
16
考核结果分析：引物交叉情况说明
H9N2的N2引物与H3N2的交叉 情况
我们发放的禽流感引物和人季节性流感引物在同种亚型之 间是可能存在交叉的，7号其实是H3N2标本。
93.3
26
86.7
5
16.7
5.实验室的管理
❖ 通过对生物安全工作、实验分区、标准操作规程以及 实验相关信息记录等4个方面考察各省CDC实验室管 理的情况。
表6 各省CDC实验室管理情况
பைடு நூலகம்
调查方面
N
n
％
生物安全工作
-生物安全水平
BSL-2
30
BSL-3
30
-生物安全说明或SOP 30
-实验人员定期培训
7
所用毒株名称： ❖H1N1: A/Jiangsuxinghua/33/2007 ❖H3N2: A/Jiangsuguangling/316/2007 ❖B: By/Fujianggulou/1774/2007 ❖ H5N1：A/Xinjiang/1/2006(H5N1) ❖H9N2: A/chicken/Foshan/48/98(H9N2)
45
核酸检测防污染几点建议
❖ 标本接收分装、核酸操作、PCR反应体系配制、 电泳操作应当在不同房间进行。不同房间使用的 防护服、移液器和枪头不应混用，标本分装和 PCR反应体系配制的区域不应接触到核酸，并有 单独的实验防护用品。
❖ 一次实验过程中按从清洁区到核酸区的顺序进行， 从污染区去清洁区应更换外防护服。
有如下操作规程
-病毒RNA提取
30
-RT-PCR检测
30
-核酸电泳检测
30
-核酸电泳
30
-污染控制
30
n
％
14
83.3
29
16.7
30
100
30
100
30
100
30
100
30
100
30
100
30
100
29
96.7
调查方面
实验相关信息记录 -检测日期 -样品编号 -试剂货号 -试剂保质日期 -实验操作人员签名 -共同检测人员签名 不同标本保存温度得当 -原始样品 -病毒核酸 -cDNA -PCR产物
3
调 查总 结
❖ 本次问卷的调查的目的在于对各省级CDC流感/禽流感检 测网络实验室的仪器配置，试剂和耗材的使用、个人防护 设备、检测工作内容及应用，以及实验室的管理等方面进 行了解和促进。
❖ 作为流感/禽流感检测的网络实验不仅需要良好的是实验 仪器及防护设备的配置，来保证日常工作快速、安全的运 转，同时也需要在实验室的管理上进行提高，从而使得检 测结果的高标准和可重复性。
8
考核标本的定量结果
标本亚型 H5 10-1 H5 10-2 H5 10-3
H5 10-4 H5 10-5 H1 H3 H9
AM CT 值 17.32 22.00 24.90
27.90 30.74 18.17 16.68 20.86
H5 Ct 值 16.27 20.97 23.85
27.69 30.55
%
Roche
30
6
20
Qiagen
30
30
100
Sigma
30
6
60
Invitrogen
30
4
13.3
Promega
30
14
46.7
其它
30
8
26.7
表3各省级CDC常用耗材供应商情况
供应商名称
N
n
％
Axygen
30
28
93.3
Griener
30
6
20
Costar
30
9
30
其它
30
4
13.3
3.个人防护设备
30
-员工上岗资格认证
30
-指定人员负责生物安全 30
25
83.3
5
16.7
30
100
30
100
30
100
30
100
调查方面
N
实验分区
-样品处理和检测有独立实验室
30
-样品接收有独立房间或指定区域
30
-体系配制有独立房间或指定区域
30
-核酸提取有独立房间或指定区域
30
-PCR产物检测有独立房间或指定区域 30
6
考核标本的设计
考核标本共10份盲样，均为病毒裂解液。分别为禽 流感H5N1标本4份，H9N2标本1份，H3N2和B型 混合标本1份，H1N1标本1份，B型标本1份，阴性 标本2份，病毒浓度均控制在易检范围之内。
H5N1标本为病毒原液10-1-10-4的梯度稀释，以此 结果来判定核酸检测的灵敏度是否合格；H3N2标本 混有B型，此项内容考核结果判定；阴性标本考核是 否有交叉污染出现。
❖ 各省级CDC个人防护设备基本齐全
❖ 个别省级CDC缺少个别防护设备 如 有的CDC缺少N95口罩，有些省缺少面罩。
表4 各省级CDC个人防护设备
个人防护设备
N
n
％
连体防护服 护目镜 面罩 防护鞋套 N95口罩
30
30
100
30
29
96.7
30
25
83.3
30
30
100
30
29
96.7
4.检测标本的内容及检测方法的应用
❖ 怀疑有核酸污染的区域需要用水大量擦洗台面地 面及仪器表面，保持通风。
❖ 怀疑有核酸污染的试剂耗材不应继续使用。
❖ 辽宁、上海、山东、湖南4个省级CDC除了对人类标本样 品进行流感病毒检测之外，还对动物来源的样品进行检测。
❖ 通过对各省级CDC禽流感检测方法应用的调查可以反映出 各省级CDC日常检测工作的内容。广西壮族自治区CDC日 常工作的内容仅为快速流感检测，而河北、上海、浙江、 河南、广东5个省级CDC除了调查表中提到的4个检测方 法的应用外，还分别进行不同类别的检测，如爆发疫情的 检测、人流感病毒亚型的鉴别、呼吸道病毒鉴别诊断、不 明原因肺炎病例检测、环境标本检测。
病例数
病毒分离 核酸检测 血清学检测
22
+
+
3
+
+
2
+
1
+
1
+
3
流感网络实验室核酸考核进程 2006年核酸考核：参考品制备和网络实验室评价检测。 制备标准品包括：病毒裂解液、体外转录RNA、 样品包括不同检测的灵敏度设灰色检测区、统一配发核 酸提取试剂和引物。 2007年核酸考核：了解各省禽流感核酸检测能力 考核标本：病毒裂解液、不同时发放核酸提取试剂和 引物
实验室管理
调查结果
检测标本的内容 及检测方法的应用
个人防护设备
1.各省级CDC PCR仪器配置情况
❖ 仪器设备非常好
▪ 上海市、浙江省、广东省（PCR仪三台，Real-time PCR仪两台）
❖ 仪器设备较好
▪ 黑龙江、安徽、江西、甘肃、宁夏回族自治区（两种类型的PCR 仪各有两台)
❖ 仪器设备充足
NIC 推荐one-step PCR引物更新
目的基 原使用引物
因
新推荐引物 引物序列
甲型 Am
FluA-M-F65
FluA-M-R400
M 336bp FluA-M-F30
FluA-M-F173 FluA-M-R382
FluA-M-
5’- TTC TAA CCG AGG TCG AAA CG -3’ 5’- ACA AAG CGT CTA CGC TGC AG -3’
RNP-Forward 5’-AGA TTT GGA CCT GCG AGC G-3’
RNP -Reverse 5’-GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT-3’
RNP
RNP-probe
5’-TTC TGA CCT GAA GGC TCT GCG
CG-3’
sample
NC
Am
H5
PC
RNP
AM 209bp R264
H5
H5HA-F920
H5HA-F248
5’- GTG ACG AAT TCA TCA ATG TRC CG -3’ 5’- CTC TGG TTT AGT GTT GAT GTY CCA A
H5HA-R1138 H5-R647 -3’
AN1-F580 5’-TGA AGT ACA ATG GCA TAA TAA CWG
▪ 具备PCR仪、Real-time PCR各一台
2.各省级CDC常用试剂及耗材供应商情况
❖ 流感中心推荐使用的试剂和耗材 ❖ 常用试剂（Takara） ❖ Promega、Qiagen（常用） ❖ Roche、Sigma的试剂（发达省份）
表2各省级CDC常用试剂及耗材供应商情况
供应商名称
N
n
主要存在的问题： 1. 实验体系没有对照。 2. 对仪器操作不够熟悉。
24
考核结果分析：Realtime结果
25
考核结果分析：Realtime结果
26
下一步工作方向 进一步完善和优化鉴定引物。 进一步优化反应体系。 优化实验和结果判定方案。
27
问卷调查情况
PCR仪器 配置情况
常用试剂及耗材 供应商情况
宁夏、贵州两省H5N1 的10-4稀释度标本 未检出。
广西首次H5N1与H9N2均未检出，第二次 提交全部正确。
阴性标本均无问题，没有污染情况发生。
12
国家流感中心
考核结果分析
完整的标注应当有样品名，引物名，片断大小， Marker梯度等等。
13
考核结果分析：实验结果标注不清
很多省份标注不够规范。
17
考核结果分析：引物交叉情况说明 甲型鉴定引物的交叉情况
18
考核结果分析：鉴定的思路
19
国家流感中心
考核结果分析：鉴定的思路
20
国家流感中心
考核结果分析：鉴定的思路
21
考核结果分析：RT-PCR
22
国家流感中心
考核结果分析：RT-PCR
23
考核结果分析：Realtime结果
所提交的结果当中25个省份做了realtime， 其中18个省份结果较好
2007年禽流感核酸检测考核结果汇报
1
核酸检测是禽流感检测的一种重要手段 ➢ 快速、灵敏、特异性高 多种因素影响检测的结果 ➢ 标本的采集 ➢ 核酸的提取 ➢ 反应体系的优化，包括引物探针的设计，试剂的选择 ➢ 熟练的操作 ➢ 良好的实验室管理
2
2005年以来中国大陆H5N1 人禽流感确诊病例实验室 诊断
N1
AN1-F550 AN1-R1164
AN1-R918
ACA C -3’ 5’- CCA CTG CAT ATA TAT CCT ATT TGA
TAC TCC -3’
注：原推荐引物仍可使用
Realtime PCR 检测的内参
内参RNP（ribonuclease P：核糖核酸酶）序列
基因
引物和探针 序列
表5 各省CDC检测标本内容和检测方法应 用
检测内容/检测方法的应用 N
n
％
检测内容
-检测人类标本
30
-检测动物标本
30
检测方法应用
-禽流感疑似病例标本检测 30
-有病禽接触史病人的监测 30
-快速流感检测
30
-流感病毒亚型检测
30
-其它类别的检测
30
30
100
4
13.3
29
96.7
19
63.3
28