基因的克隆与表达ppt课件
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转化
受体细胞
筛选阳性克隆 大量扩增，获得子代DNA
二、克隆载体
复制基因(replicator) 选择性记号 克隆位点
三、受体细胞
1、定义：外源DNA导入的细胞，是 重组体扩增的场所。 2、要求：易于接纳外源DNA
无特异的内源性核酸内切酶 载体复制、扩增不受阻 与载体有互补性
四、体外重组的策略
终止子（terminator，T）:位于基因3’
端,给予RNA聚合酶转录终止信号的 DNA序列
6、与转译有关的原核细胞结构：—— 核糖体结合位点
转译起始密码子AUG 或GUG
SD顺序（shine-dalgarno）：
• AUG上游3-11 bp
• 长约3-9bp
• mRNA与16s核糖体亚基间的识别与 结合序列
1、粘末端连接 1）全同源粘末端连接 • 最方便简单 • 高背景-载体自身环化 • 双向插入
2）定向克隆：使外源基因定向插入到载体 中的克隆策略
• 粘-粘连接：最有效、最快捷
• 粘-平连接：适用于外源基因仅与载体有 一个相同酶切位点，可将另一末端补平
2、平末端连接：
• 酶切点为平末端或任何两个末端补平 的DNA
• 效率低，酶用量大
3、人工接头连接
人工接头：人工合成含有酶切位点的寡 核苷酸片段
4、T-A克隆
• T-vector两条链的5’端含有一个游 离的T
• PCR过程中，普通的Taq酶可在产 物的3’端多加一个A
五、基因克隆的工作流程 （一）目的基因的获得 1、直接分离 3、构建cDNA文库 4、PCR 5、人工合成 6、差异显示
1、直接分离DNA—适用于克隆原核生物 的基因组文库
2、构建基因组文库，筛选目的基因
• 基因组文库(gene library)：将某 种生物的基因组DNA切割成一定大 小的片段，并与合适的载体重组后 导入宿主细胞，进行克隆。这些存 在于所有重组体内的基因组DNA片 段的集合，即基因组文库，它包含 了该生物的所有基因。
• cDNA文库仅包含正在表达的基因 • 不同物种、不同组织的cDNA文库不相同 • 基因总量少，易筛选
4、PCR扩增目的基因片段
• 适用于克隆序列清楚的基因
• 以基因组DNA为模板，直接进行PCR 扩增较难
• 多采用以mRNA为模板的RT-PCR法
5、人工合成较短的DNA
6、差异显示法(differential display, DD)—筛选差异表达的基因
（二）体外重组 连接体系的建立： • 温度：粘末端连接：12-18℃
平末端连接：室温（低于30℃) • DNA量：载体分子数/目的基因分子数
=1：1-3 • 酶量：平端连接时需加大酶量
（三）转化—Cacl2法、电击法 （四）重组子的筛选及鉴定 1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑）
原位杂交 2、鉴定： • 长度鉴定：酶切、PCR • 方向鉴定：联合酶切 • 测序
•构建流程
抽提基因组 DNA 鸟枪法制备DNA片 段 DNA片段与载体重组
转化宿主菌
筛选目的基因（核酸探针法、 免疫结合法）
• 特点及应用： 包含所有遗传信息 构建难度大（单拷贝基因、长片段基因） 筛选难度大 用于研究基因在基因组中的情况
3、构建cDNA文库，筛选目的基因
• cDNA文库(complementary DNA library)以组织细胞中的mRNA为模 板，反转录合成双链cDNA ，各 cDNA分子分别插入载体形成重组子， 再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重 组体内的cDNA的集合即cDNA文库。
基因的克隆与表达
基因克隆(gene cloning) 基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
基因克 隆 Gene Cloning
概述 克隆载体 受体细胞 体外重组的策略 基因克隆工作流程
一、概述
• 确定了遗传信息的携带者，即基因的盆 子载体是DNA而不是蛋白质
启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合
酶识别、结合并启动基因转录的一段 DNA序列。
• 一般长40-60bp，富含A-T碱基对
Байду номын сангаас• 具有保守序列：
-10区（pribnow box）：TATAAT
-35区：
• RNA聚合酶识别并结合启动子，但并不开始转录
• 各种启动子启动转录能力不同。
• 启动子强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其间 隔序列
操纵子（operon）：是一组功能上相 关，受同一调控区控制的基因组成的 一个遗传单位
• 原核生物基因表达的基本单位（即一 个转录单位）。
• 共同协调作用，完成某一多肽的表达 调控。
• 包括：调控区(调节基因，启动基因， 操作基因)、 结构基因
5、原核生物中参与转录的基因结 构：
• 启动子
• 终止子
• 揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机理
• 提出了中心法则和操纵子学说，破译了 遗传密码
1973年Cohen完成第一个基因工程实验 经体外重组获得杂合DNA 杂合子转化入大肠杆菌
所需元件： 限制性内切酶 连接酶 载体 受体细胞
基因克隆的技术路线
目的基因
载体
体外重组
重组子（杂合DNA）
二．原核生物基因结构和表达特点
1. 原核生物染色体DNA是裸露的环形 DNA，其转录和翻译是偶联的连续 进行。
2. 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体 结合，翻译形成多条肽链。
3、一般不含内含子（intron），没有转 录及翻译后加工系统
4、原核生物中功能相关的基因串联在 一起，形成操纵子。
三．外源基因在原核表达系统中表达 的必要条件：
1. 删除内含子和5’非编码区
2. 外源基因置于强启动子和SD顺序控制 下
3. 维持正确开放阅读框架（ORF）
4. mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋 白质不被降解
基因的表达
Gene Expression
一．表达系统：
基因工程中用来获得有功能的异源蛋白 质的体系，包括克隆载体，表达载体及 受体细胞。
据受体细胞的不同可分为：
1．原核表达系统：
将外源基因引入原核细胞，并使其在原 核细胞中以发酵形式快速高效地表达、 合成基因产物的体系。
2．真核表达系统：使外源基因在真核细 胞中表达的体系。
受体细胞
筛选阳性克隆 大量扩增，获得子代DNA
二、克隆载体
复制基因(replicator) 选择性记号 克隆位点
三、受体细胞
1、定义：外源DNA导入的细胞，是 重组体扩增的场所。 2、要求：易于接纳外源DNA
无特异的内源性核酸内切酶 载体复制、扩增不受阻 与载体有互补性
四、体外重组的策略
终止子（terminator，T）:位于基因3’
端,给予RNA聚合酶转录终止信号的 DNA序列
6、与转译有关的原核细胞结构：—— 核糖体结合位点
转译起始密码子AUG 或GUG
SD顺序（shine-dalgarno）：
• AUG上游3-11 bp
• 长约3-9bp
• mRNA与16s核糖体亚基间的识别与 结合序列
1、粘末端连接 1）全同源粘末端连接 • 最方便简单 • 高背景-载体自身环化 • 双向插入
2）定向克隆：使外源基因定向插入到载体 中的克隆策略
• 粘-粘连接：最有效、最快捷
• 粘-平连接：适用于外源基因仅与载体有 一个相同酶切位点，可将另一末端补平
2、平末端连接：
• 酶切点为平末端或任何两个末端补平 的DNA
• 效率低，酶用量大
3、人工接头连接
人工接头：人工合成含有酶切位点的寡 核苷酸片段
4、T-A克隆
• T-vector两条链的5’端含有一个游 离的T
• PCR过程中，普通的Taq酶可在产 物的3’端多加一个A
五、基因克隆的工作流程 （一）目的基因的获得 1、直接分离 3、构建cDNA文库 4、PCR 5、人工合成 6、差异显示
1、直接分离DNA—适用于克隆原核生物 的基因组文库
2、构建基因组文库，筛选目的基因
• 基因组文库(gene library)：将某 种生物的基因组DNA切割成一定大 小的片段，并与合适的载体重组后 导入宿主细胞，进行克隆。这些存 在于所有重组体内的基因组DNA片 段的集合，即基因组文库，它包含 了该生物的所有基因。
• cDNA文库仅包含正在表达的基因 • 不同物种、不同组织的cDNA文库不相同 • 基因总量少，易筛选
4、PCR扩增目的基因片段
• 适用于克隆序列清楚的基因
• 以基因组DNA为模板，直接进行PCR 扩增较难
• 多采用以mRNA为模板的RT-PCR法
5、人工合成较短的DNA
6、差异显示法(differential display, DD)—筛选差异表达的基因
（二）体外重组 连接体系的建立： • 温度：粘末端连接：12-18℃
平末端连接：室温（低于30℃) • DNA量：载体分子数/目的基因分子数
=1：1-3 • 酶量：平端连接时需加大酶量
（三）转化—Cacl2法、电击法 （四）重组子的筛选及鉴定 1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑）
原位杂交 2、鉴定： • 长度鉴定：酶切、PCR • 方向鉴定：联合酶切 • 测序
•构建流程
抽提基因组 DNA 鸟枪法制备DNA片 段 DNA片段与载体重组
转化宿主菌
筛选目的基因（核酸探针法、 免疫结合法）
• 特点及应用： 包含所有遗传信息 构建难度大（单拷贝基因、长片段基因） 筛选难度大 用于研究基因在基因组中的情况
3、构建cDNA文库，筛选目的基因
• cDNA文库(complementary DNA library)以组织细胞中的mRNA为模 板，反转录合成双链cDNA ，各 cDNA分子分别插入载体形成重组子， 再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重 组体内的cDNA的集合即cDNA文库。
基因的克隆与表达
基因克隆(gene cloning) 基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
基因克 隆 Gene Cloning
概述 克隆载体 受体细胞 体外重组的策略 基因克隆工作流程
一、概述
• 确定了遗传信息的携带者，即基因的盆 子载体是DNA而不是蛋白质
启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合
酶识别、结合并启动基因转录的一段 DNA序列。
• 一般长40-60bp，富含A-T碱基对
Байду номын сангаас• 具有保守序列：
-10区（pribnow box）：TATAAT
-35区：
• RNA聚合酶识别并结合启动子，但并不开始转录
• 各种启动子启动转录能力不同。
• 启动子强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其间 隔序列
操纵子（operon）：是一组功能上相 关，受同一调控区控制的基因组成的 一个遗传单位
• 原核生物基因表达的基本单位（即一 个转录单位）。
• 共同协调作用，完成某一多肽的表达 调控。
• 包括：调控区(调节基因，启动基因， 操作基因)、 结构基因
5、原核生物中参与转录的基因结 构：
• 启动子
• 终止子
• 揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机理
• 提出了中心法则和操纵子学说，破译了 遗传密码
1973年Cohen完成第一个基因工程实验 经体外重组获得杂合DNA 杂合子转化入大肠杆菌
所需元件： 限制性内切酶 连接酶 载体 受体细胞
基因克隆的技术路线
目的基因
载体
体外重组
重组子（杂合DNA）
二．原核生物基因结构和表达特点
1. 原核生物染色体DNA是裸露的环形 DNA，其转录和翻译是偶联的连续 进行。
2. 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体 结合，翻译形成多条肽链。
3、一般不含内含子（intron），没有转 录及翻译后加工系统
4、原核生物中功能相关的基因串联在 一起，形成操纵子。
三．外源基因在原核表达系统中表达 的必要条件：
1. 删除内含子和5’非编码区
2. 外源基因置于强启动子和SD顺序控制 下
3. 维持正确开放阅读框架（ORF）
4. mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋 白质不被降解
基因的表达
Gene Expression
一．表达系统：
基因工程中用来获得有功能的异源蛋白 质的体系，包括克隆载体，表达载体及 受体细胞。
据受体细胞的不同可分为：
1．原核表达系统：
将外源基因引入原核细胞，并使其在原 核细胞中以发酵形式快速高效地表达、 合成基因产物的体系。
2．真核表达系统：使外源基因在真核细 胞中表达的体系。