电化学发光免疫检测原理

电化学发光免疫检测原理

电化学发光免疫测定的基本原理 (Electrochemiluminescence immunoassay,ECLI)

是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定以后的新一代标记免疫测定技术，是电化学发光(ECL)和免疫测定相结合的产物。它的标记物的发光原理与一般的化学发光(CL)不同，是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光二个过程。ECL与CL的差异在于ECL是电启动发光反应，而CL是通过化合物混合启动发光反应。ECL 不仅可以应用于所有的免疫测定，而且还可用于DNA,RNA探针检测。

2+其检测原理(以TSH检测为例):第一步:结合了活化的三联吡啶钌衍生物即[Ru(bpy)] + N3羟基琥珀酰胺酯(NHS)的TSH抗体和结合了生物素的TSH抗体与待测血清同时加入一个反应杯中孵育9分钟。

第二步:将被链霉亲和素包被的磁珠加入反应杯中，再次孵育9分钟，使生物素通过与亲和素

的结合将磁珠、TSH抗体连接为一体，形成双抗体夹心法。

2+下一步，蠕动泵将形成的 [Ru(bpy)],抗体,抗原,抗体,磁珠复合体吸入流动测量室，此3

时，磁珠被工作电极下面的磁铁吸附于电极表面。同时，游离的TSH抗体(与生物素结合的和2+与[Ru(bpy)]结合的抗体)也被吸出测量室。 3

紧接着，蠕动泵加入含三丙胺(TPA)的缓冲液，同时电极加电压，启动ECL反应过程。发光2+剂 [Ru(bpy)]和电子供体TPA在阳极表面可同时各失去一个电子而发生氧化反应，使二价的32++?[Ru(bpy)]被氧化成三价，后者是一种强氧化剂;另一方面，TPA 被氧化成阳离子自由基TPA，3+?后者很不稳定，可自发失去一个质子(H)，形成自由基TPA，这是一种很强的还原剂，可将3+2+一个电子给三价的[Ru(bpy)]，使其形成激发态的[Ru(bpy)]，而TPA自身被氧化成二丙胺332+和丙醛。激发态的[Ru(bpy)]通过荧光机制衰减，发射出一个波长620nm的光子，重新生成32+基态的[Ru(bpy)]。该过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，光电倍增管检测光32+强度，光强度与[Ru(bpy)]的浓度呈线性关系,故可测出待测抗原的含量。 3

最后，终止电压，移开磁珠，加入清洗液冲洗流动测量室，准备下一个样品测定。

IMMULITE ?

美国德普(DPC)公司开发成功的IMMULITE ?型酶放大化学发光自动化分析仪及其配套的各项检测试剂盒是在IMMULITE系统条件下发展完善的.它以聚苯乙烯塑料珠为固相载体, 碱性磷酸酶(APase)标记抗体(或抗原),并作用于发光底物AMPPD[3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″磷酰氧基)苯基-1,2二氧乙烷].

专利清洗技术

IMMULITE技术的核心是测试杯。它可以自动进行彻底的包被珠清洗。测试杯是生化反应容器，其中有一个特异性抗体包被珠。高速旋转测试杯可以将杯中的液体彻底甩入测试杯的外腔。测试杯可以进行多次持续数秒钟的高速离心清洗，从而使游离标记物有效地分离出来。DPC独特地离心清洗技术稳定地实现了极低的非特异性结合。这是提高检测性能的关键。

图1 图2 图3 图4

样本和试剂自动加入测试杯，温育结束，测试杯垂直高速旋几次清洗后，游离标记物彻底加入发光底物，高灵敏光电倍在37度进行振荡温育转。反应液被彻底甩入外腔。地被分离出去增管读取发光计数

连续化学发光

IMMULITE的酶放大化学发光比“快闪”化学发光的检测下限要低。“快闪”化学发光每个免疫结合只发出一两个光子，而IMMULITE的却是几千个光子。自动衰减器可以有效地扩展发光技术达100倍。酶放大的持续发光信号产生过程，允许多次计数以得到更加精巧的结果。

传统的化学发光

IMMULITE 酶放大化学发光

ACCESS2 化学发光检测原理(

Beckmancoulter ACCESS2全自动微粒子化学发光免疫分析系统

)

检测原理

1 大分子 Access 分析是一个双位点夹心法(Sandwich)的酶免疫分析，采用了两个针对CEA不同抗原位点的大鼠抗-CEA单抗。样品被加入反应管，同时加入的还有用作酶结合物的标记了碱性磷酸酶的抗CEA第一位点的大鼠单抗和与磁性颗粒结合的抗-CEA第二位点的二抗，而后，反应管被传送到磁性分离区域进行多次冲洗，去处未和固相结合的其它成分。最后，化学发光底物， Lumi-Phos* 530被加入反应管，与反应体系中存在的碱性磷酸酶进行反应，发出的光量子被光电比色计所检测。产生的光子与样本中的CEA浓度成正比。最后，对照仪器中储存的多点定标曲线中所描述的光量子与标准品CEA的对应关系而计算出样品中的CEA浓度。

2 小分子Access 总T4检测是一种竞争抑制的酶免疫方法，样品和抗甲状腺素抗体、标记了碱性磷酸酶的甲状腺素酶结合物和包被了羊抗大鼠捕获抗体的磁性颗粒及用以破坏T4与血清中蛋白结合的消化剂一起加入到反应管中，样品中的T4和酶结合物竞争结合有限的特异性抗甲状腺素抗体，形成的抗原抗体复合物通过捕获抗体与磁性颗粒相结合。随后，在磁性分离系统去除未与磁性颗粒结合的其它复合物，最后在反应管中加入化学发光底物(Lumi-Phos* 530), 已与固相结合的碱性磷酸酶会使该底物发出光子并被光电比色计所检测。最后，对照仪器中储存的多点定标曲线中所描述的光量子与标准品的对应关系而计算出样品中的总T4浓度，反应产生的光子与样品中总T4的含量成反比。